炎癥對脂肪酸負荷的腎細胞FAT/CD36表達的影響*

萬克強， 廖俊蕾， 趙 蕾， 李 青， 陳壓西， 阮雄中

(重慶醫科大學脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，教育部感染性疾病分子生物學重點實驗室，重慶400016)

慢性腎臟疾病患者往往有不同程度的脂質代謝紊亂，它既是許多原發或繼發性腎臟疾病的常見臨床表現，又參與了腎臟疾病的發生發展。研究發現，在腎臟疾病早期就會有血清游離脂肪酸(free fattyacid，FFA)增高。腎臟是FFA重要的代謝器官，也是脂肪酸β氧化產生能量的主要場所。脂肪酸在腎臟細胞的異常跨膜轉運對慢性腎臟疾病的發生和發展起了不可忽視的作用。隨著慢性腎臟疾病的發展，機體往往出現全身持續低度的炎癥反應，而炎癥可進一步加重腎臟損害的進程。近來研究表明，炎癥可以通過干擾介導細胞內脂質代謝平衡的一些分子表達，改變脂質在體內的轉運和分布，導致脂質過多地沉積在組織細胞內，造成組織器官損害［1－3］。脂肪酸轉運蛋白(fatty acid transporter，FAT/CD36)在調節脂肪酸在腎臟的跨膜轉運起到重要作用。正常狀態下，FAT/CD36作為B類清道夫受體在巨噬細胞有一定表達，而有實驗發現糖尿病大鼠巨噬細胞CD36表達較正常組增加［4］，則提示與一些病理改變有關。炎癥是否能干擾腎細胞FAT/CD36表達而進一步導致腎臟細胞脂肪酸代謝紊亂卻鮮見報道。因此本研究旨在應用人系膜細胞(human mesangial cells，HMCs)和腎小管上皮細胞HK－2作為體外實驗模型，初步觀察在炎癥和脂肪酸負荷狀態下腎細胞FAT/CD36的表達以及胞內脂質的積聚情況。

材料和方法

1 材料

改良型 RPMI－1640培養基、胎牛血清(Hy-Clone);軟脂酸、油紅O(Sigma);腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－α)(PeproTech Asia);白細胞介素6(interleukin－6，IL－6)(SinoBio);Trizol RNA提取劑、PrimeScript? RT reagent kit和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);細胞總蛋白提取試劑盒(Keygen);PCR引物通過TaqMan Primer Express軟件設計，上海生物工程公司合成;β－actin兔單抗IgG、FAT/CD36兔單抗IgG和goat anti－rabbit IgG－HRP(Santa Cruz)。

2 主要方法

2.1 細胞培養 HMCs用含10%胎牛血清及1%胰島素－轉鐵蛋白－亞硒酸鈉(insulin－transferrinsodium selenite，ITS)的改良型 RPMI－1640培養基，HK－2細胞用含10%胎牛血清的改良型RPMI－1640培養基，在37℃、5%CO2孵箱培養，1～2 d換液，3～4 d傳代。

2.2 實驗分組 將匯合度達90%的HMCs和HK－2細胞更換無脂肪酸培養基RPMI－1640+0.2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)培養24 h，將不同濃度軟脂酸(0 mmol/L、0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.32 mmol/L)處理 HMCs和 HK－2細胞 24 h，觀察 FAT/CD36 mRNA和蛋白的表達。進一步選取軟脂酸0.04 mnol/L，再聯合炎癥因子處理細胞，分為6組:(1)對照組 (control):RPMI－1640+0.2%BSA;(2)軟脂酸組 (palmitate):RPMI－1640+0.2%BSA+0.04 mmol/L軟脂酸;(3)TNF－α組:RPMI－1640+0.2%BSA+25 μg/L TNF－α;(4)IL－6組:RPMI－1640+0.2%BSA+20 μg/L IL－6;(5)軟脂酸聯合TNF－α組(palmitate+TNF－α):RPMI－1640+0.2%BSA+0.04 mmol/L palmitate+25 μg/L TNF－α;(6)軟脂酸聯合IL－6組(palmitate+IL－6):RPMI－1640+0.2%BSA+0.04 mmol/L palmitate+20 μg/L IL－6，培養24 h后做相應檢測。

2.3 實時定量PCR檢測FAT/CD36的mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA，在PrimeScript? RT Enzyme MixⅠ作用下逆轉成cDNA，反轉錄條件是:37℃ 15 min，85℃ 5 s。以2 μL cDNA作實時定量PCR檢測FAT/CD36 mRNA表達，同時以 β－actin作為內參照，擴增反應:50℃ 2 min，95℃ 5min預變性;95℃ 20 s，55℃ 20 s，40個循環。反應體系為 25 μL。數據計算步驟是:ΔCt=CtFAT/CD36－Ctβ－actin;ΔΔCt= 處理組 ΔCt－對照組 ΔCt;處理組FAT/CD36 mRNA 表達為對照組的 2－ΔΔCt倍，即處理組FAT/CD36 mRNA相對表達量。設計的引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1.Human TaqMan primers for real－time PCR

2.4 Western blotting檢測FAT/CD36蛋白表達 提取的細胞總蛋白用BCA法蛋白定量并標化統一濃度，上樣50～100 μg至6%SDS－PAGE凝膠電泳，再電轉至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，兔抗FAT/CD36單克隆抗體(1∶200)和兔抗β－actin單克隆抗體(1∶3 000)，4℃孵育過夜。TBST清洗3次，10 min/次，Ⅱ抗均是1∶7 500稀釋比例37℃孵育1.5 h。TBST清洗3次，10 min/次，ECL光化學法顯色。

2.5 油紅O染色 將細胞種入6孔板，進行細胞爬片油紅 O染色:PBS清洗3次，10%甲醛鹽固定30 min;PBS清洗2次，1，2－丙二醇孵育2 min后吸盡，油紅O染色30 min;雙蒸水清洗3次，蘇木素復染2 min;洗凈后甘油明膠封片。

2.6 酶比色法檢測細胞內甘油三脂(triglyceride，TG)水平 收集細胞沉淀加入正庚烷、異丙醇混合抽提劑(2∶3.5)。超聲破碎細胞，離心后上清真空干燥后比色法進行TG定量，而沉淀用1 mol/L NaOH溶解。24 h后進行Lowry總蛋白定量，計算TG與細胞總蛋白含量的比值，即各組TG相對含量。

2.7 ELISA檢測細胞內FFA水平 收集細胞沉淀加入氯仿、正庚烷、甲醇混合抽提劑(56∶42∶2)。超聲破碎細胞，離心后上清真空干燥，ELISA進行FFA定量，而沉淀用1 mol/L NaOH溶解。24 h后進行Lowry總蛋白定量，計算FFA與細胞總蛋白含量的比值，即各組FFA相對含量。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件，進行方差分析比較不同處理組各項指標的差異，數據以均數±標準差(±s)表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度脂肪酸對HMCs和HK－2細胞 FAT/CD36 mRNA表達的影響

當負荷的軟脂酸濃度的增加，2種細胞FAT/CD36 mRNA表達也隨之增加，呈劑量依賴性。其中，HMCs在0.16 mmol/L軟脂酸濃度下、HK－2細胞在0.08 mmol/L軟脂酸濃度下FAT/CD36 mRNA表達相對于0 mmol/L濃度組有增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。在0.32 mmol/L組2種細胞 FAT/CD36 mRNA表達相對于0 mmol/L濃度組增加更明顯(P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Palmitate up－regulated the mRNA expression of FAT/CD36 in a concentration－dependent manner in HMCs and HK－2 cells.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L palmitate group.圖1 軟脂酸呈濃度依賴性上調HMCs和HK－2 FAT/CD36 mRNA表達

2 不同濃度脂肪酸對HMCs和HK－2細胞 FAT/CD36蛋白表達的影響

Western blotting顯示，不同濃度的軟脂酸處理HMCs和HK－2細胞24 h后，隨著軟脂酸的濃度增加，2種細胞FAT/CD36蛋白表達也增加，與細胞FAT/CD36 mRNA表達結果一致，見圖2。

Figure 2.Palmitate up－regulated the protein expression of FAT/CD36 in a concentration－dependent manner in HMCs and HK－2 cells.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L palmitate group.圖2 軟脂酸呈濃度依賴性上調HMCs和HK－2 FAT/CD36蛋白表達

3 TNF－α和IL－6對脂肪酸負荷的HMCs和HK－2細胞FAT/CD36 mRNA表達的影響

25 μg/L TNF－α 和20 μg/L IL－6炎癥因子組與對照組相比，單純炎癥因子組FAT/CD36 mRNA表達均有增加，且有統計學意義(P＜0.05)。TNF－α組和IL－6組聯合0.04 mmol/L軟脂酸處理組與單純軟脂酸處理組相比，FAT/CD36 mRNA表達均明顯增加，差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effects of palmitate(0.04 mmol/L)combined with TNF－α or IL－6 on the mRNA expression of FAT/CD36 in HMCs and HK－2 cells.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs palmitate group.圖3 軟脂酸聯合TNF－α和IL－6對HMCs和HK－2細胞FAT/CD36 mRNA表達的影響

4 TNF－α和IL－6對脂肪酸負荷的HMCs和HK－2細胞FAT/CD36蛋白表達的影響

Western blotting顯示，TNF－α 25 μg/L和IL－6 20 μg/L處理的負荷有0.04 mmol/L軟脂酸的HMCs和HK－2細胞FAT/CD36蛋白表達明顯增加，與mRNA表達結果一致，見圖4。

Figure 4.Effects of palmitate(0.04 mmol/L)combined with TNF－α or IL－6 on the protein expression of FAT/CD36 in HMCs and HK－2.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs palmitate group.圖4 TNF－α和IL－6對軟脂酸負荷的HMCs和HK－2細胞FAT/CD36蛋白表達的影響

5 TNF－α和IL－6對脂肪酸負荷的HMCs和HK－2細胞內脂質積聚的影響

油紅O染色顯示，在低濃度軟脂酸下，HMCs和HK－2細胞內脂質出現輕微增加;TNF－α和IL－6處理后，紅染明顯增加，脂質明顯增多;而聯合處理的腎細胞較單純軟脂酸處理的細胞，脂質進一步積聚。同時檢測HMCs和HK－2細胞內TG含量，結果與油紅O染色結果一致，見圖5、6。

通過酶免疫分析法檢測HMCs和HK－2細胞內FFA含量，并計算其相對量。0.04 mmol/L軟脂酸組與對照組相比，HMCs和HK－2細胞內FFA均增加不明顯;聯合處理組腎細胞相對于單純軟脂酸組來說，HMCs和HK－2細胞內FFA增加更明顯，差異顯著(P ＜0.05)，見圖7。

討 論

近來研究認為，脂質代謝紊亂是慢性腎臟疾病發生發展的關鍵環節，當機體處于代謝綜合征狀態下，可以引起腎臟內脂質沉積和腎損傷［5］。“脂質腎毒性學說”認為，體內長期保持高游離脂肪酸水平，可以誘導腎細胞凋亡及促使糖尿病的發生，同時腎臟損害又可以導致脂質代謝紊亂［6－8］。腎細胞脂肪酸的攝取代謝過程中有許多代謝酶參與，其中脂肪酸轉運酶FAT/CD36是參與腎細胞脂肪酸代謝重要酶之一。FAT/CD36廣泛存在于骨骼肌細胞、心肌細胞、脂肪細胞以及血管內皮細胞等各種組織細胞中，扮演著清道夫受體的角色，又參與長鏈脂肪酸轉運、胰島素抵抗和動脈粥樣硬化形成的過程。Chabowski等［9］研究 ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠在糖尿病前期胰島素抵抗階段，高脂喂養的青年大鼠出現骨骼肌FAT/CD36表達增加，同時使脂肪酸轉運增加66%，而且高脂飲食的小型豬同樣出現脂質代謝紊亂，胸主動脈、肝組織、腎組織FAT/CD36表達均增加。本研究也在體外實驗中得出:脂肪酸負荷的腎細胞FAT/CD36表達增加，胞內脂質積聚增多。高濃度脂肪酸刺激細胞FAT/CD36 mRNA和蛋白的表達，當細胞FAT/CD36增加時，脂肪酸的攝取也會增多。Kuchibhotla等［10］研究認為FAT/CD36可能不僅參與攝入修飾的脂蛋白所致動脈粥樣硬化的過程，而且參與促進動脈粥樣硬化的炎癥過程。本實驗中，在炎癥因子刺激下的腎細胞FAT/CD36表達也增加，說明炎癥反應與組織細胞FAT/CD36的表達可能存在一個潛在的互動機制。

近來相關研究認為，慢性腎臟疾病隨著腎功能進行性損害常表現出以單核巨噬細胞系統激活，伴隨TNF－α、IL－6和C－反應蛋白等促炎癥因子釋放的慢性炎癥過程［11］。炎癥可以刺激腎小球系膜細胞分泌多種炎癥細胞因子，如IL－6、IL－1，而這些細胞因子可通過旁分泌或自分泌的方式使炎癥效應不斷放大，最終導致腎小球硬化和糖尿病腎病發生［12］。我們課題組通過大量體外實驗證實并提出:炎癥不僅可以改變脂質代謝平衡，而且還是脂質誘導腎臟損害的中間環節與關鍵因素［13－14］。

Figure 5.Lipid accumulation in HMCs and HK－2 cells examined by oil red O staining after palmitate treatment combined with TNF－α or IL－6(×400).A－F:HMCs;G－L:HK－2;A，G:control;B，H:TNF－α 25 μg/L;C，I:IL－6 20 μg/L;D，J:palmitate 0.04 mmol/L;E，K:palmitate 0.04 mmol/L plus TNF－α 25 μg/L;F，L:palmitate 0.04 mmol/L plus IL－6 20 μg/L.圖5 TNF－α和IL－6對軟脂酸負荷的HMCs和HK－2細胞內脂質積聚的影響

Figure 6.TG level in HMCs and HK－2 cells after palmitate(0.04 mmol/L)treatment combined with TNF－α or IL－6.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs palmitate group.圖6 TNF－α和IL－6對軟脂酸負荷的HMCs和HK－2細胞內脂質積聚的影響

Figure 7.FFA level of HMCs and HK－2 cells after palmitate(0.04 mmol/L)treatment combined with TNF－α or IL－6.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs 0.04 mmol/L palmitate group.圖7 軟脂酸聯合TNF－α和IL－6對HMCs和HK－2細胞內FFA水平的影響

目前，炎癥對腎細胞脂肪酸轉運的影響機制還不是十分清楚。本實驗觀察到，不管是人系膜細胞(HMCs)還是人腎小管上皮細胞(HK－2)，在模擬正常人或代謝綜合征早期，處于低濃度脂肪酸水平的細胞FAT/CD36 mRNA和蛋白增加均不明顯。然而在低濃度脂肪酸負荷條件下，炎癥因子刺激的腎細胞FAT/CD36表達比單純低濃度脂肪酸組增加更明顯。而炎癥因子刺激增加的FAT/CD36也會使腎細胞攝取更多的脂肪酸。通過油紅O染色和腎細胞HMCs和HK－2細胞內游離脂肪酸含量的測定進一步證實這一結果。實驗結果說明:炎癥因子可以進一步上調脂肪酸負荷的腎細胞FAT/CD36的表達，以及加重胞內脂質積聚。該研究為闡明炎癥可能作為獨立致病因子在脂質介導的腎損害中的作用機制提供了理論依據，FAT/CD36途徑可作為一個切入點為新藥開發及臨床治療提供線索。

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