鋅酞氰介導的光動力學療法對小鼠Lewis肺癌細胞的影響研究*

李維娜 楊繼慶* 劉淵聲 文 峻 翟明明 屈學民

肺癌是最近50年以來全球范圍內發病率和病死率增長最快的惡性腫瘤，目前在很多世界發達國家和部分發展中國家已排到惡性腫瘤的第一位[1-2]，其治療手段主要有手術療法、化學療法、放射療法和新近出現的分子靶向療法[3-4]等。盡管各種治療手段均有很大進步，但5年生存率仍＜15%[5]。因此，如何更有效的治療肺癌成為當今研究的熱點。

光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)是一種新的腫瘤治療手段，具有快速起效、毒性較低和治療創傷小等優點，在癌癥治療方面有著非常廣泛的應用。本實驗研究鋅酞氰(Zinc Phthalocyanine,ZnPc)介導的光動力學療法(ZnPc-PDT)對小鼠Lewis肺癌細胞的影響，探索了ZnPc-PDT殺傷Lewis肺癌細胞的最佳工作參數，為后期的動物體內實驗提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗細胞

小鼠Lewis肺癌細胞株：由第四軍醫大學遺傳與發育教研室惠贈，常規復蘇，傳代接種后，取其生長良好的第三代細胞完成本次實驗。

1.2 主要試劑和儀器

ZnPc購自上海TCI公司，在暗室中稱取ZnPc粉末11.5 mg，加入二甲基亞砜(DMSO)溶劑10 mL，待充分溶解后，避光分裝后-20 ℃避光保存，添加DMSO配制成所需的不同濃度的溶液即可。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sino-American Biotec公司，以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制MTT溶液5 mg/mL；過濾除菌，分裝后避光-20 ℃保存。本實驗還用到中國臺灣BD Bioscience公司的凋亡試劑盒Annexin V/PI，培養基RMPI 1640等。

應用的主要儀器有670 nm DL-Y半導體激光治療儀(第四軍醫大學數理教研室研制)，光功率計(LM-91C型)，紫外分光光度計(日本HITACHI公司),酶標儀(北京東勝創新公司)，流式細胞儀(美國BD Bioscience公司)等。

1.3 MTT檢測法

接種小鼠Lewis肺癌細胞1×105個于96孔板內，加入光敏劑，4 h后進行光照；避光孵育12 h后每孔加入10 μl MTT溶液，恒溫孵箱繼續培養4 h；棄去培養基，加入100 μl DMSO，避光搖動混勻15 min；酶標儀測量492 nm處吸光度值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

接種小鼠Lewis肺癌細胞2×104個于24孔板內，加入光敏劑，4 h后進行光照；避光孵育12 h后收集所有貼壁和懸浮細胞，用流式細胞儀進行分析。

1.5 數據分析

采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行處理和分析。

2 實驗結果

2.1 ZnPc的光譜特性分析

利用分光光度計分別檢測了ZnPc的吸收峰。如圖1所示，ZnPc的吸收峰出現在670 nm處，因此本實驗選擇輸出波長為670 nm的激光器激發ZnPc。

2.2 光敏劑濃度對Lewis細胞殺傷作用的影響對比研究

接種小鼠Lewis肺癌細胞于96孔板，加入ZnPc和溶液，濃度調節到0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L，避光培養4 h，然后在暗室中用670 nm的激光光照5 min，激光能量密度均為120 mW/cm2。

圖1 ZnPc的吸收峰

2.2.1 用MTT檢測法檢測PDT對細胞增殖的變化

用MTT法檢測ZnPc-PDT對小鼠Lewis細胞的抑制率，用吸光度A492nm表示細胞的存活率(見表1)。

由表1數據可知，隨著ZnPc濃度水平的增加，Lewis細胞在492 nm處的吸光值逐漸減小。利用t檢驗對相鄰濃度的兩組光敏劑分別進行比較可知，15 μmol/L和10 μmol/L時作用效果無顯著性差異(t=1.739，P＞0.05)，其他相鄰濃度水平間均存在顯著性差異。

2.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

加入ZnPc使濃度分別達到10 μmol/L和20 μmol/L進行PDT處理，將經過ZnPc介導的PDT處理后的小鼠Lewis肺癌細胞，用流式細胞儀檢測，左上角表示壞死細胞所占比例，右上角表示晚期凋亡細胞所占比例，左下角表示活細胞所占比例，右下角表示早期凋亡細胞所占比例(如圖2所示)。

圖2 不同濃度時流式細胞術分析結果

由圖2顯示，隨著光敏劑濃度的增加，活細胞所占的比例逐漸減小。光敏劑濃度為0時，活細胞所占比例為87.78%；光敏劑濃度為10 μmol/L的ZnPc-PDT時活細胞所占比例為38.93%；光敏劑濃度為20 μmol/L的ZnPc-PDT時活細胞所占比例為26.24%，說明ZnPc介導的PDT的作用效果均比較明顯，ZnPc-PDT在低濃度為10 μmol/L時即有較強的殺傷效果。

表1 濃度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

表1 濃度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

5 μmol/L和0 μmol/L比較，P=0.003； 10 μmol/L和5 μmol/L比較，P=0.001；15 μmol/L和10 μmol/L比較，P=0.133； 15 μmol/L和20 μmol/L比較，P=0.014

表2 光照時間對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

表2 光照時間對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

1 min與0 min比較，P=0.000； 2 min與1 min比較，P=0.001；3 min與2 min比較，P=0.039； 5 min與3 min比較，P=0.303

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表3 功率密度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

表3 功率密度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

30 mW/cm2與0 mW/cm2比較，P=0.000； 60 mW/cm2與30 mW/cm2比較，P=0.001；90 mW/cm2與60 mW/cm2比較，P=0.082； 120 mW/cm2與90 mW/cm2比較，P=0.540

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2.3 光照時間對Lewis細胞殺傷作用的對比研究

接種小鼠Lewis肺癌細胞于96孔板，加入ZnPc溶液，濃度為20 μmol/L，避光培養4 h，然后在暗室中分別用635 nm和670 nm的激光光照0 min、1 min、2 min、3 min、5 min，激光能量密度均為120 mW/cm2。

2.3.1 用MTT檢測法檢測PDT對細胞增殖的變化

用吸光度A492nm表示細胞的存活率，比較0 min、1 min、2 min、3 min、5 min兩種光敏劑對細胞的殺傷效果見表2。

由表2數據可知，隨著光照時間的增強，ZnPc介導的PDT對小鼠Lewis肺癌細胞的殺傷作用逐漸增強，表現為492 nm處的吸光度值在逐漸減小。當光照時間為0 min、1 min、2 min、3 min時相鄰兩組間t值分別為12.68，6.257，2.631，P值均＜0.05，不同時間段的作用效果存在顯著性差異；5 min和3 min時t=1.126，P＞0.05，無統計學意義，作用效果無顯著性差異。隨著照射時間的增長，PDT對細胞的殺傷作用逐漸增強，但當時間達到一定值后則失去統計學意義。

2.3.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖3 不同光照時間時流式細胞術分析結果

將經過ZnPc-PDT處理后的小鼠Lewis肺癌細胞，用流式細胞儀檢測結果如圖3所示。在進行ZnPc-PDT時，光照時間為0時，活細胞所占比例為88.62%；光照時間為2 min的ZnPc-PDT時活細胞所占比例為46.23%，5 min時活細胞所占比例為26.24%。說明ZnPc-PDT對Lewis肺癌細胞的殺傷效果明顯，ZnPc-PDT在光照2 min時即有較強的殺傷效果。

2.4 光源功率密度對小鼠Lewis肺癌細胞殺傷作用的對比研究

接種小鼠Lewis肺癌細胞于96孔板，加入ZnPc溶液，濃度20 μmol/L，避光培養4 h，然后在暗室中分別用635 nm和670 nm的激光光照5 min，激光能量密度分別為0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2。

2.4.1 用MTT檢測法檢測ZnPc-PDT對細胞增殖的變化

用吸光度A492nm表示細胞的存活率，比較激光能量密度分別為0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2時，兩種光敏劑對細胞的殺傷效果見表3。

由表3數據可知，隨著功率密度的增強，ZnPc-PDT對Lewis細胞的殺傷作用均逐漸增強。當激光功率密度為0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2時，相鄰組間t=9.059,5.812，P＜0.05，不同功率密度的作用效果存在顯著性差異；當激光功率密度為60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2時，相鄰組間t=2.085,0.6505，P＞0.05，無統計學意義，作用效果無顯著性差異。隨著功率密度的增強，PDT對細胞的殺傷作用逐漸增強，但當功率密度大到60 mW/cm2后則失去統計學意義，可能因殺傷能力已趨于飽和。

2.4.2 用流式細胞儀檢測細胞凋亡

將經過ZnPc-PDT處理后的小鼠Lewis肺癌細胞，用流式細胞儀檢測結果如圖4所示。光功率密度為0時，活細胞所占比例為91.09%，光功率密度為60 mW/cm2時ZnPc-PDT活細胞所占比例為40.31%，120 mW/cm2時活細胞所占比例為26.24%。說明ZnPc-PDT的作用效果比較明顯，在功率密度為60 mW/cm2時即有較強的殺傷效果。

圖4 不同功率密度時流式細胞術分析結果

3 討論

目前，利用PDT治療肺癌方面的研究多以血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative，HPD)為光敏劑[6-8]，而HPD作為一代光敏劑的代表，雖然有著廣泛的應用，但其組織選擇性較差，光毒性較強，避光時間較長等缺點成為制約其發展的主要原因[9-10]。ZnPc屬于二代光敏劑，具有避光時間短，代謝速度快，組分單一等特點，目前已在臨床上廣泛應用，而關于其在肺癌方面的研究還未見報道[11-12]。

本實驗通過光譜分析可知光敏劑ZnPc的峰值單一，吸收峰波長為670 nm，說明其組分單一，不良成分較少；波長較長，對組織的穿透能力較強。在研究ZnPc-PDT中其濃度對小鼠Lewis肺癌細胞的殺傷作用時利用MTT法和流式細胞技術均顯示，PDT的療效在一定范圍內隨光敏劑濃度的增加而增強，但增強到一定值(10 μmol/L)以后相鄰濃度不具有顯著性差異，可能是由于殺傷能力已達到飽和。流式細胞技術顯示，ZnPc-PDT在低濃度(10 μmol/L)時即有較強的殺傷效果。

在研究光照時間對Lewis肺癌細胞的殺傷作用時，同樣MTT法和流式細胞技術檢測發現，PDT的療效在一定范圍內隨光照時間的增加而增強，MTT法顯示當兩者光照時間為3 min和5 min時，t=1.126，P＞0.05，不具備統計學意義，說明作用效果無顯著性差異，可能是殺傷能力已達到了飽和。流式細胞技術顯示兩種光敏劑介導的PDT的作用效果均比較明顯，ZnPc-PDT在光照2 min時即有較強的殺傷效果。在研究激光功率密度對ZnPc介導的PDT對Lewis肺癌細胞的殺傷作用時，MTT法和流式細胞技術結果顯示對于同一種光敏劑，PDT的療效在一定范圍內隨光源功率密度的增加而增強，MTT法顯示兩種光敏劑在能力密度達到60 mW/cm2以后，相鄰光強下的細胞殺傷能力不具備統計學意義，可能是光敏化能力已趨于飽和。ZnPc-PDT在低功率密度下(60 mW/cm2)即有較強的殺傷效果。

以上結果表明，ZnPc-PDT對Lewis肺癌細胞的殺傷作用隨光敏劑濃度、光照時間、光源功率密度的增加而增強，但增強到一定值后會趨于飽和；并且由ZnPc的譜線圖可知，ZnPc的波峰相對單一即說明其成分單一，對細胞的毒副作用相對較小；ZnPc的波長較長，因此其對組織的穿透能力更強。研究初步表明，在肺癌方面ZnPc-PDT是一種高效，低不良反應的治療方法，但需要在下一步的動物體內實驗進行驗證。

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