多藥耐藥基因作用的新發現

宋 鵬，段蘊鈾，黃友章，吳海波

海軍總醫院質量管理科，北京 100048

在臨床上使用一種化療藥對腫瘤患者實施化療后，治療后的腫瘤細胞可同時對多種不同結構的其他抗癌藥也產生耐藥性，這種現象稱為多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）。人類腫瘤細胞多藥耐藥的經典途徑是由多藥耐藥基因（MDR1 Gene）轉錄出 MDR1 mRNA，再由 MDR1 mRNA 翻譯的糖蛋白（P-gp）介導的[1]。這種ATP酶依賴的跨膜蛋白P-gp，有將天然來源的藥物泵出細胞的功能，這可使細胞內的藥物濃度降低而導致MDR[2]。臨床上有時患者在外照射后對其后的化療不再敏感，即外照射也表現出了MDR表型。本文主要是觀察被照射的小細胞肺癌細胞系在外照射前后其總RNA、MDR1 mRNA、藥物敏感性以及放射敏感性的變化，從而探討多藥耐藥基因是否還有其他未被揭示的新作用。

1 材料與方法

1.1 材料

上海科學院細胞庫購得NCI-H446小細胞肺癌細胞系。該細胞系的生物學性狀參見文獻[3]，其培養條件參見文獻[4]。細胞生長進入指數期后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 照射條件 采用中國核動力研究設計院實驗工廠生產的GWGP80型遠距離60Co治療機，照射條件參見文獻[4]。

1.2.2 細胞的外照射 當NCI-H446細胞進入指數生長期后，用0.25%胰酶消化，并將吹勻的細胞懸液移入75 ml的細胞培養瓶中進行培養，等細胞貼壁并匯合后進行外照射，照射劑量為2 Gy/次（戈瑞，輻射吸收劑量單位），中間恢復3 d，總的外照射劑量為50 Gy[5]。

1.2.3 外照射前后NCI-H446細胞總RNA的提取 分別取照射前后的NCI-H446細胞約1×107個，用PBS將NCI-H446細胞沖洗2遍，離心后棄上清液，各加1 ml Gibco公司生產的Trizol，吹打使NCI-H446細胞溶解，用氯仿液抽提后，加入異丙醇沉淀，用70%乙醇洗滌，然后涼干，最后加0.1%DEPC水溶解總RNA。提取后的總RNA經紫外分光光度計260 nm定量。

1.2.4 RT-PCR RT-PCR的詳細過程參見參考文獻[4]。

1.3 不同濃度的絲裂霉素（MMC）對外照射前后兩組細胞存活率的影響

1.3.1 配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC 配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC的具體方法參見參考文獻[6]。絲裂霉素的血漿峰濃度為 0.5 μg/ml[7]。

1.3.2 制備外照射前后兩組細胞相同濃度的單細胞懸液 具體方法參見參考文獻[6]。

1.3.3 細胞毒性試驗 具體方法參見參考文獻[6]。

1.3.4 不同濃度絲裂霉素作用下兩組細胞的平均存活率 細胞存活率的計算公式[8]如下：

細胞的平均存活率是每組6個樣本的細胞存活率的平均數，數據以均數±標準差（）表示。在相同的條件下細胞的存活率高，提示相對耐藥；反之，則相對敏感。

1.4 加逆轉劑維拉帕米后不同濃度絲裂霉素（MMC）對外照射前后兩組細胞存活率的影響

1.4.1 配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC 方法同本文的“1.3.1”，但不用生理鹽水稀釋，而用細胞培養液1640溶解。

1.4.2 逆轉劑維拉帕米的配制 取12.45 ml的1640培養液加50 μl的5 mg/ml的維拉帕米即可制成濃度為20 μg/ml的維拉帕米溶液[9]。

1.4.3 制備外照射前后兩組細胞的單細胞懸液 方法同本文的“1.3.2”。

1.4.4 細胞耐藥性的逆轉實驗 具體方法參見參考文獻[6]。

1.4.5 計算不同濃度絲裂霉素作用下和加入逆轉劑維拉帕米后兩組細胞的平均存活率 見“1.3.4”所述。

1.5 外照射前后NCI-H446細胞放射敏感性的變化

1.5.1 外照射前后NCI-H446細胞存活率（S）的變化 實驗分Sc組和Rc組，每組各取3.5 cm的細胞培養皿18個。每個培養皿加入細胞300個，再加入1640應用液1.5～2.0 ml，每組細胞的18個培養皿再分成6小組，每組3個皿。分別給予0、2、4、6、8和10 Gy 6個不同劑量的外照射。1周后計算兩組細胞的集落形成率（PE）和每小組細胞的存活率（S），并比較兩組細胞的PE和在相同劑量外照射條件下的存活率。同時取原本細胞組的存活率最接近50%的外照射劑量作為下一步實驗的外照射劑量。PE和S的計算公式如下：

1.5.2 兩組細胞生長狀況和細胞死亡率的差別[10-11]取Sc和Rc各5組，每組3個培養皿，每個皿中加入指數生長期細胞1×104個，培養2～3 d，使其貼壁并進入指數生長期，按步驟“1.5.1”確定的2 Gy放射劑量作為測試兩組細胞放射敏感性的外照射劑量。使用這個外照射劑量同時一次性照射兩組共30個培養皿的細胞。照射后分別于第2、4、6、8和10天各取1組共6個皿進行細胞計數，取每組3個皿細胞的平均數作為最后結果。每次將做完細胞計數的剩余單細胞懸液加入離心管，以1500 r/min的轉速離心5 min，然后棄上清液，加入0.5%臺酚藍2～3滴將細胞染色，染色后的細胞點滴在血球計數板上，分別計數活細胞（白色）和死亡細胞（藍色），算出細胞死亡率（P）。細胞死亡率的計算公式如下：

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料數據以均數±標準差（）表示，兩樣本間均數比較采用獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外照射前后NCI-H446細胞的總RNA濃度

在相同細胞數和相同體積的前提下，照射前后NCIH446細胞總RNA的濃度分別為25.9 mg/L和16.6 mg/L。

2.2 外照射前后NCI-H446細胞MDR1 mRNA的RT-PCR結果

外照射前后NCI-H446細胞MDR1 mRNA的RT-PCR的結果見圖1。除最上面的條帶Mr（DL2000）外，從上至下可見四條帶，它們依次為未照射細胞的β-actin cDNA（簡寫為β-actin cDNA）、照射細胞的β-actin cDNA （簡寫為P-βactin cDNA）、未照射細胞的MDR1 cDNA（簡寫為MDR1 cDNA）和照射細胞的MDR1 cDNA（簡寫為P-MDR1 cDNA）。這四條帶經Gelbase電腦軟件進行光密度掃描所得的平均光密度（OD）值分別為 59.49、49.76、64.14 和 66.60。 這樣 P-MDR1 cDNA/P-β-actin cDNA 為 1.388， 而 MDR1 cDNA/β-actin cDNA為1.078。

圖1 小細胞肺癌細胞系外照射前后其多藥耐藥基因表達的變化

2.3 外照射前后兩組細胞在不同濃度絲裂霉素作用下其存活率的變化

結果見表1和圖2。

表1 兩組細胞在不同濃度絲裂霉素作用下其平均存活率的變化（）

表1 兩組細胞在不同濃度絲裂霉素作用下其平均存活率的變化（）

R c組S c組t值 P值組別 0.1 P P C 0.8420±0.10380.7082±0.00342.5706＜0.011 P P C 0.6935±0.00170.5232±0.02212.5706＜0.0110 P P C 0.5518±0.00200.3445±0.00242.5705＜0.0120 P P C 0.4240±0.00180.3025±0.00052.5706＜0.01

圖2 兩組細胞在不同濃度絲裂霉素的干擾下其平均存活率的變化

2.4 外照射前后兩組細胞在加入逆轉劑維拉帕米后，其不同濃度絲裂霉素作用下存活率的變化

結果見表2。

表2 細胞在加入逆轉劑后，其不同濃度絲裂霉素作用下平均存活率的變化（，%）

表2 細胞在加入逆轉劑后，其不同濃度絲裂霉素作用下平均存活率的變化（，%）

注：與 Rc 組比較，aP＞0.05，bP＜0.01

R c組S c組組別 0.1 P P C 0.9340±0.08950.9730±0.0380 a 1 P P C 0.8090±0.03580.9430±0.0420 b 10 P P C 0.1100±0.05390.1250±0.0230 a 20 P P C 0.0640±0.00690.0550±0.0120 b

2.5 兩組細胞在不同劑量外照射下的集落形成數、集落形成率和存活率的結果

結果見表3。

表3 兩組細胞在不同劑量外照射條件下平均集落形成數（XS、XR）（300 個細胞/皿）和平均存活率（SS、SR）（）

表3 兩組細胞在不同劑量外照射條件下平均集落形成數（XS、XR）（300 個細胞/皿）和平均存活率（SS、SR）（）

注：*因無干擾因素，實際上是兩組細胞未照射前的集落形成率（PES、PER）；與 Rc組比較，aP＜0.05

外照射劑量（G y）平均集落形成數S c組 R c組平均存活率（%）S c組 R c組0246810134.00±24.0068.66±21.3326.00±8.0000039.33±1.3331.33±5.339.33±1.335.33±1.3344.67±17.11*51.24±11.88 a 19.40±5.59 a 2.97±0.9913.11±0.15*79.67±34.4823.73±8.6224.48±3.39000000

3 討論

在臨床上，化療和放療是治療腫瘤患者常用的兩種方法，但存在的主要問題是化療后耐藥。在臨床工作中筆者也發現了另一個現象，即放療后患者有時也會對其后的化療和再放療產生耐受，這個現象引起了筆者的關注，繼而探討放療是否也會對被照射細胞的MDR1 gene有影響，并進而影響其后的藥物敏感性和放射敏感性。基于上述原因，筆者設計了本課題，希望通過對體外培養的小細胞肺癌細胞系實施分次外照射，來觀察其對被照射細胞的總RNA和MDR1 mRNA的表達變化以及其對被照射細胞的藥物敏感性和放射敏感性所產生的影響，為今后的臨床工作提供基礎醫學的根據。

MDR1 mRNA是細胞總RNA的組成部分，筆者很關注對體外培養的細胞在外照射后其總RNA的變化。外照射后對細胞總RNA的生物合成是有影響的，多數學者認為外照射后細胞總RNA的生物合成下降；相反的意見也同樣存在。研究者考慮這可能是由于細胞的代謝狀況、生長周期和取樣時間不同所造成的[12]。本實驗表明，細胞受50 Gy的外照射后，其總RNA的濃度由25.9 mg/L下降到了16.6 mg/L，生物合成受到明顯抑制。

MDR1 mRNA的表達增強是導致MDR的主要原因，因此，探討細胞受外照射后是否導致其后的化療呈MDR表型也應該首先觀察外照射后其MDR1 mRNA的表達變化。本研究通過對小細胞肺癌NCI-H466細胞系實施分次外照射建立了完成根治性外照射劑量的小細胞肺癌細胞系模型。從結果中圖1可見，除最上面的條帶Mr（DL2000）外，從上至下可見四條帶，它們依次為未照射細胞的β-actin cDNA（簡寫為β-actin cDNA）、照射細胞的 β-actin cDNA（簡寫為 P-β-actin cDNA）、未照射細胞的MDR1 cDNA（簡寫為 MDR1cDNA）和照射細胞的MDR1 cDNA（簡寫為P-MDR1cDNA）。這四條帶經Gelbase電腦軟件進行光密度掃描所得的平均OD值分別為：59.49、49.76、64.14 和 66.60。 這樣 P-MDR1 cDNA/P-βactin cDNA 為 1.388，而 MDR1 cDNA/β-actin cDNA 為1.078。這兩個比值反映了細胞照射以后和未照射前其MDR1 mRNA的相對含量。比值大則反映其MDR1 mRNA的表達強。這樣，從結果中可以看出照射后的比值1.388比照射前的比值1.078明顯增大，表明NCI-H446小細胞肺癌細胞經體外總劑量為50 Gy的外照射后其MDR1 mRNA的表達增強。這意味著此種細胞很有可能對其后的化療耐藥。

上面探討了外照射對NCI-H446小細胞肺癌細胞系MDR1 mRNA的影響，結果表明其表達增強，但該細胞是否對其后的化療耐藥尚需做藥敏方面的實驗來證實。本文采用了噻唑藍（MTT）法[6]，實測了兩組細胞在不同濃度化療藥物的干擾下，其各自不同的存活率，從而判斷其不同的藥物敏感性。1983年Mosman[13]首先將MTT法用于細胞毒試驗的檢驗，目前該法廣泛用于體外抗癌藥物敏感試驗。活細胞（紅細胞除外）中線粒體脫氫酶對可溶性MTT分解、轉化，產生一種藍紫色結晶物——甲臜。甲臜溶解于二甲基亞砜（DMSO）中變成紫紅色溶液，在600 nm左右波長中測定其顏色的強度，它的顏色和活細胞成正比，因此根據其顏色的強弱可反映活細胞的多少，從而推算出腫瘤細胞在抗癌藥物中的存活率。腫瘤細胞的存活率越低，說明此種化療藥物對腫瘤細胞殺傷力越強，即敏感性越高，反之則敏感性越低[14]。

從本結果中表1和圖2可見，外照射后的體外細胞，在不同濃度的絲裂霉素作用下，照射后細胞的存活率均明顯高于未照射細胞。此實驗結果表明，外照射后NCI-H446細胞的體外化療藥物敏感性已經降低，換句話說即體外耐藥性提高。日本富田騰朗和美國Salmon等均研究過體外藥物試驗和體內臨床用藥的關系。他們的研究結果是兩者的相符合率為90%左右[8]。這個結論表明體外和體內細胞的耐藥性關聯性很高。從表1和圖2的結果還可以看到，隨著干擾藥物濃度的提高，兩組細胞的存活率平穩地下降，這說明本研究設計的干擾藥物濃度較為合適。

上面的結果表明外照射后被照射細胞對其后的化療產生了耐藥性。那么這種耐藥性是否也可以被增敏劑所逆轉呢？為此，筆者做了如下的實驗，即給已經產生了耐藥的細胞加入了一種常用的化療增敏劑維拉帕米，來觀察其耐藥性是否可以被逆轉。從表2可以看到，兩組細胞在加入逆轉劑維拉帕米后，在化療藥絲裂霉素的濃度分別為0.1、10和20 PPC時，存活率比較差異無統計學意義（P＞0.05），這表明Rc組細胞的耐藥已被逆轉；而在絲裂霉素的濃度為1 PPC時，Rc組細胞的存活率反而明顯低于未照射的Sc組細胞（P＜0.01），這表明Rc組細胞的耐藥表現不僅被逆轉，且在這種情況下比Sc組細胞更敏感。實驗結果說明今后在肺癌化療時可以考慮同時應用化療逆轉藥物。但有的逆轉藥劑量小時不起太多的作用，而劑量大時其帶來的副作用患者又難以忍受，因此，使用受到限制[15]。為了解決這個問題，臨床上曾使用兩種逆轉藥物聯用的辦法，取得了良好的逆轉效果[9]。

本實驗結果表明外照射不僅可以使被照射細胞的MDR1 mRNA表達增強，而且被照射細胞還對其后的化療藥產生了耐藥性，并且這種耐藥性可以被常規使用的化療增敏劑所逆轉。對外照射后被照射細胞對其后的放療反應的問題，筆者對Sc和Rc再給予相同劑量的外照射，來觀察這兩種細胞對相同條件的外照射的反應。從表3結果可知，首先，Sc與 Rc的集落形成率 （PE）分別為 （44.67±17.11）%和（13.11±0.15）%，差異有高度統計學意義（P＜0.01），表明 NCIH446細胞經50 Gy的外照射后，其集落形成能力下降明顯；其次，在分別給予2 Gy和4 Gy的外照射后，Rc系的存活率（S）分別為（79.67±34.48）%和（23.73±8.62）%，而 Sc 系的存活率（S）分別為（51.24±11.88）%和（19.40±5.59）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。 說明在 2～4 Gy范圍內，Rc系較 Sc系對外照射的抵御能力增強明顯。提示經過外照射后，腫瘤細胞耐外照射的能力增強。臨床上也有這個現象，即在放療過的部位再放療時，效果明顯降低。Fertil等[16]認為測定體外細胞的放射敏感性是判定腫瘤放療反應的一個非常有用的指標。Williams等[17]也認為測定細胞放射敏感性可預測臨床放療效果；第三，本實驗表明，當放療劑量達8 Gy/次或以上時，兩組細胞的存活率（S）均為0。這提示臨床上如果單次放射劑量很大時，照射野內的腫瘤細胞有可能被全部殺死，但同時正常細胞可能也難逃厄運。

綜上所述，筆者可以得出如下結論：外放射可以使體外培養的腫瘤細胞的MDR1 mRNA表達增強；這種被照射細胞由于其MDR1 mRNA的表達增強，它對其后的化療藥產生了耐藥性，并且這種耐藥性還可以被化療增敏劑所逆轉；不僅如此，被照射的細胞對其后的放療也產生了耐受。表明化療藥以外的損傷因素也可以使多藥耐藥基因表達增強，而這些損傷因素所引起的多藥耐藥基因的高表達均可以使細胞對后來的其他損傷因素（如放療等）產生耐受。因此，多藥耐藥基因應改稱耐多種損傷基因似乎更能體現其內涵。

[1]Thorgeirsson SS,Huber BE,Sorrell S,et al.Expression of the multidrugresistant gene in hepatocarcinogenesie and regenerating rat liver[J].Science,1987,236(4805):1120-1122.

[2]章小平,楊紅枚,魯功成,等.膀胱癌MRP亞克隆的建立及其MDR表性型[J].中華腫瘤雜志,2000,22(3):273-275.

[3]Gazdar AF,Carney DN,Arion M,et al.Characterization of variant subclasses of cell lines derived from small cell lung cancer having distinctive biochemical,morphological,and growth properties[J].Cancer Research,1985,45(6):2924-2930.

[4]段蘊鈾,宋鵬,聶青,等.外照射對體外培養的小細胞肺癌細胞系總RNA及多藥耐藥基因的影響[J].北京醫學,2002,24(4):254-256.

[5]Sanchez AM,Barrett JT,Schoenlein PV,et al.Fractioned ionizing radiation accelerates loss of amplified MDR1 genes harbored by extrachromosomal DNA in tumor cells[J].Cancer Research,1998,58(17):3845-3854.

[6]宋鵬,段蘊鈾,楊建軍,等.維拉帕米對外照射導致的小細胞肺癌細胞系耐藥性的逆轉作用[J].解放軍醫學雜志,2007,32(4):365-367.

[7]陳歷排,周昊,李志陽,等.用微量板ATP生物發光法檢測腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[J].腫瘤,2000,20(2):103.

[8]唐偉,譙體義,陳在賢,等.自體腫瘤細胞藥敏檢測指導膀胱癌術后化療[J].重慶醫學,1999,28(2):94-96.

[9]胡江文,沈振亞,楊吉成,等.γ-干擾素與維拉帕米聯合逆轉人肺癌細胞系的多藥耐藥[J].蘇州大學學報:醫學版,2003,23(1):17.

[10]李建人,趙彼得,羅沈如,等.高熱合并化療放療對人結腸癌細胞的作用[J].中華理療雜志,1995,18(3):131-133.

[11]梁利波,千新來,馬業偉,等.EIA基因對人肺腺癌細胞增殖和細胞周期的影響[J].中華結核和呼吸雜志,2001,24(11):663-665.

[12]夏壽萱.放射生物學[M].北京:軍事醫學科學出版社,1998:90-91.

[13]Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immuno Meth,1983,65(1-2):55-63.

[14]Hoff DD,Casper J,Bradier E,et al.Association between human tumor colony-forming assay results and response of an individual patient′s tumor to chemotherapy[J].Am J Med,1981,70(5):1027-1041.

[15]王寶成,李志,郭軍,等.TAM 對非小細胞肺癌經NVB-DDP 方案誘導耐藥性逆轉的臨床觀察[J].中國腫瘤臨床,2003,30(9):656.

[16]Fertil B,Malaise EP.Intrinsic radiosensitivity of human cell lines is correlated with radioresponsiveness of human tumors:analysis of 101 published survival curves [J].Int J Radiat Oncol Binl Phys,1985,14(11):1699-1706.

[17]Williams M,Lyu M,Yang Y,et al.IER5,a novel member of the slow kinetics immediate-early genes[J].Genomics,1999,55(3):327-334.