Mir-181 a通過靶向c-fos基因抑制肺癌細胞遷移

林述琨 溫吉海 王耀鵬

1.大連普蘭店市中心醫院病理科；2.普蘭店市中心醫院肺外科

MicroRNA(miRNAs)是一類在生物體內普遍存在的單鏈非編碼蛋白質小分子RNA，研究表明，它們可以特異性識別靶基因mRNA的3’UTR并與之結合，引起靶mRNAs發生降解或翻譯受到抑制[1,2]。近年來研究發現，miRNA在多種人類腫瘤的發生、發展中起癌基因或抑癌基因的作用[3,4]。Chen等[5]研究表明，miR-181a可以作用于凋亡相關Bcl-2蛋白，增加膠質瘤細胞U87MG對放療的敏感性；同時也有研究表明，miR-181在EpCAM(+)AFP(+)的肝癌中的表達水平明顯的升高，且與預后不良相關[6]。MiR-181在肺癌中的研究目前尚未見報道。本研究通過transwell小室、生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因等方法，探討miR-181a對肺癌細胞遷移的影響及其調控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和轉染 人肺腺癌細胞株A549，用含有10%新生牛血清，100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素的DMEM培養液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。當細胞生長至對數生長期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)說明書的方法進行轉染。細胞轉染48h后提取細胞總RNA和蛋白進行后續相關實驗。

1.2 Real-time PCR 用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA后反轉錄為cDNA(Takara)。miR-181a的反轉錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTC ACC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GCC GAA ACA TTC AAC GCT CTC -3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT -3′。以U6為內參，反轉錄引物序列為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′-TGC GGG TGC TCC GCT TCG GCA GC-3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。使用SYBR Green(Takara)染料法進行反應，95℃預變性10min，95℃變性5s，60℃退火34s，74℃熒光檢測3s，共40個循環。以2–ΔΔCt值比較兩者之間的差異。每組重復設置3個復孔。

1.3 雙熒光素酶報告基因檢測 應用生物信息學預測軟件對 miR-181a 進行靶基因預測，選c-fos為候選靶基因，以基因組DNA為模版，擴增包括miR-181a 結合位點在內的c-fos 3'UTR區，克隆到 pMir-Report報告基因載體的(Ambion公司)HindⅢ和 SpeI 酶切位點之間，重組載體命名為pMIR-c-fos。對pMIR-c-fos重組質粒“種子區”進行定點突變，突變后的質粒命名為pMIR-c-fos-Mut。所有構建的表達質粒均經雙酶切和測序鑒定。A549細胞在24 孔板中培養，細胞融合度為80 %左右時進行轉染，轉染分組為：miR-181a mimic+pMIR-c-fos組、miR-181a nc+pMIR-cfos、miR-181a mimic+pMIR-c-fos-Mut組和miR-181a nc+pMIR-c-fos-mut，每組設3 個復孔。轉染后繼續培養48 h，加入裂解液(100μl/孔)，離心并收集上清至96孔板中，每孔中加入40μl螢火蟲熒光素酶底物，混勻10s 后檢測熒光強度；然后再加入40μl海腎熒光素酶底物，混勻 10 s 后檢測熒光強度。將螢火蟲熒光素強度值/海腎熒光素強度值進行標準化校正。

1.4 Western blot 檢測c-fos蛋白表達水平 用RIPA細胞裂解液(含有0.1% 的PMSF)冰上裂解細胞20min，收集于1.5mL EP 管中，離心后上清液轉移至無菌EP管中，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白在SDS-PAGE中電泳，轉移到PVDF 膜上；5% 脫脂奶粉4℃過夜封閉，用c-fos的兔抗人單克隆一抗(1:1000)室溫下孵育2h(cell signal)，再用過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫下孵育2h，以β-actin 為內參，用Image J軟件分析蛋白條帶總灰度值，檢測表達差異。

1.5 Transwell小室檢測細胞遷移能力 將A549細胞培養于12孔板，在細胞融合度達80%時進行轉染。細胞轉染6h后更換為完全培養液， 繼續培養18h，然后用0.25% 的胰酶消化細胞，加入2ml完全培養液終止消化，離心后用Opti-MEM調整細胞密度為3×105個/mL的單細胞懸液。取100μl單細胞懸液移至上室內，下室中加入600μl含10%新生牛血清的 RPMI 1640培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%培養箱內培養16 h，每組設3個平行復孔。取出小室，移走上室內的培養液，用滅菌的棉棒將上室內的細胞輕輕刮掉，置于0.1%結晶紫染色液中染色30 min，取出小室，在蒸餾水中將其漂洗3次。倒置顯微鏡下觀察通過小室基膜的細胞并計數。

1.6 統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。采用t檢驗進行兩樣本間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Real-time檢測miR-181a表達 Real-time PCR檢測結果顯示miR-181a mimic 轉染組(mi)，與空白對照組(nc)相比，mi組中miR-181a的mRNA的表達量明顯增加(P<0.01，見圖1)，表明轉染miR-181a mimic后A549細胞中miR-181a表達明顯增加。

2.2 MiR-181a對A549細胞遷移能力的影響 Transwell小室檢測A549細胞在轉染miR-181a mimic后細胞遷移能力的改變，結果顯示，轉染miR-181a mimic組(MI)穿膜細胞數為291.6±17.02個/視野，而空白對照組(NC)穿膜細胞數分別為191±13.1個/視野(見圖2)，轉染miR-181a mimic組與空白對照組相比，穿膜細胞數明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明miR-181a能夠抑制A549細胞的遷移能力。

2.3 生物信息學預測c-fos是miR-181a的靶基因靶基因應用生物信息學預測軟件 TargetScan對miR-181a的靶基因進行預測，分析顯示在c-fos的3'UTR 區有7 個堿基與c-fos的“種子區”完全互補配對(見圖3)，因此生物信息學預測認為c-fos可能是miR-181a的靶基因。

2.4 雙熒光素酶報告基因分析miR-181a對c-fos的調控作用 將miR-181a mimic和融合c-fos 3'UTR 的表達質粒pMIR-c-fos共轉染A549 細胞后熒光素酶活性表達受到明顯的抑制，與轉染miR-181a nc和融合基因c-fos 3'UTR 的表達質粒pMIR-c-fos組相比差異有統計學意義(P<0.05)；轉染miR-181a mimic和融合c-fos 3'UTR“種 子 區 ”突 變 的 表 達 質 粒pMIR-c-fos-Mut 共轉染A549細胞后熒光素酶活性沒有受到抑制，與對照組轉染空載體pCDNA3.1和融合基因c-fos 3'UTR 的表達質粒的熒光素酶活性比較差異無統計學意義(見圖4)。結果表明，miR-181a能夠對c-fos 3'UTR 區起到抑制性的調控作用。

2.5 Western blot檢測miR-181a抑制c-fos蛋白表達miR-181a mimic轉染組(mi)中c-fos蛋白表達與空白對照組(mock)和亂序轉染組(nc)中c-fos蛋白表達差異明顯，c-fos在miR-181a mimic轉染組中表達明顯下調(見圖5)。結果表明，miR-181a能夠在翻譯水平上抑制c-fos蛋白表達。

3 討論

肺癌是對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 早期研究表明在部分人類癌癥發病機制中MicroRNA(miRNA)的改變可能參與調控。miRNA可以與多種靶基因結合在腫瘤發生發展過程中可起到癌基因或抑癌基因作用。本課題組前期通過芯片篩查肺癌組織和對應的癌旁組織中差異表達的miRNAs時發現，miR-181a 在癌旁組織中表達明顯高于腫瘤組織。提示miR-181a可能作為抑癌基因參與肺癌的發生。

MiR-181a基因定位于人9號染色體上，成熟序列長為23 nt，是由92 nt莖環結構前體剪切、加工而成[7]。目前尚無miR-181a與肺癌轉移關系的研究報道。通常采用化學合成小分子的miRNAs 或 構 建 miRNA表達載體進行miRNA功能研究[8,9]。本研究通過化學合成的miR-181a mimic進行后續實驗。

我們首先通過real-time PCR方法檢測了A549細胞轉染化學合成的miR-181a mimic后能夠高表達miR-181a，為正常表達水平的24.7倍。同時體外功能實驗表明miR-181a能夠抑制肺癌A549細胞的遷移。

為了探究miR-181a調控肺癌細胞遷移的分子機制，我們通過生物信息學軟件預測c-fos可能是miR-181a的靶基因，通過雙熒光素酶報告基因證實了miR-181a對c-fos的3'UTR 區具有作用的基礎上，進一步在A549細胞中通過Western blot 方法證實了miR-181a 對c-fos的表達具有抑制作用。已有研究表明c-fos的表達與肺癌的發生、轉移相關[10,11]，我們認為miR-181a可能通過抑制c-fos表達調控肺癌細胞轉移。本研究為進一步探究miR-181a在肺癌中的作用提供了思路和治療的靶點。

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