人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究*

陜西省人民醫(yī)院骨二科（西安710068）

易 智 劉時(shí)璋▲ 史 軍△ 凌 鳴 孫正明 黃向輝 強(qiáng) 輝 聶治軍 時(shí) 亮 史紀(jì)元

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是由于關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生病變、損毀及骨質(zhì)增生而導(dǎo)致的慢性關(guān)節(jié)病。常規(guī)的治療方法難以完全治愈，此病因軟骨細(xì)胞不能隨意遷移，難以快速的向損傷的位置遷移積聚，軟骨破壞后自然修復(fù)的軟骨組織為纖維軟骨而非透明軟骨，缺乏正常透明軟骨的耐用性及特有力學(xué)功能［1］。為探討人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSCs）關(guān)節(jié)腔注射治療OA的價(jià)值，我們以新西蘭大白兔建立骨關(guān)節(jié)炎模型，觀(guān)察膝關(guān)節(jié)腔注射HUCMSCs后關(guān)節(jié)液中IL－1的濃度、軟骨Mankin’s評(píng)分、滑膜組織的光鏡和電鏡改變，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 材 料 45只大耳白兔，雄性，體重2．0～2．5kg。按Vand man方法［2］建立OA模型。隨機(jī)分成OA組、干細(xì)胞治療組和生理鹽水注射對(duì)照組，每組15只。

2 方 法 在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)下對(duì)各組進(jìn)行治療處理。OA組及時(shí)處死以備用；干細(xì)胞治療組注射1×105HUMSCs于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每周注射1次，連續(xù)注射4周；對(duì)照組采用生理鹽水注射，方法與實(shí)驗(yàn)組相同，最后一次注射1周后將全部動(dòng)物處死。收集試驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液，用ELISA雙抗夾心法標(biāo)記所收集關(guān)節(jié)液中的IL－1β，酶標(biāo)儀450n m處讀取有色反應(yīng)的OD值，繪制計(jì)算曲線(xiàn)后計(jì)算IL－1β濃度值。將動(dòng)物模型滑膜和股骨髁部軟骨部分取出作為光鏡觀(guān)察標(biāo)本；滑膜使用4%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，HE染色后于電鏡下觀(guān)察滑膜形態(tài)學(xué)變化；軟骨標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定，經(jīng)15%乙二胺四乙酸脫鈣處理10周，包埋后HE染色，光鏡下觀(guān)察軟骨形態(tài)學(xué)變化。對(duì)切片進(jìn)行Mankin’s評(píng)分；將所獲得的滑膜立刻置入0．25%戊二醛中做電鏡標(biāo)本，1%鋨酸固定2h，梯度乙醇及丙西酮脫水，618環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄片機(jī)切成60n m厚薄片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀(guān)察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用T檢驗(yàn)對(duì)3組IL－1β濃度平均值、光鏡下滑膜及軟骨 Mankin’s評(píng)分進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 3組關(guān)節(jié)液中IL－1β濃度比較 干細(xì)胞治療組健側(cè)（16．37±0．44pg/ml）與 OA 組健側(cè)（14．35±0．68pg/ml）以及對(duì)照組健側(cè)（15．10±0．36pg/ml）比較，差異不顯著（P＞0．367）；干細(xì)胞治療組患側(cè)（24．33±2．20pg/ml）與 OA 組患側(cè)（20．16±1．07pg/ml）以及對(duì)照組患側(cè)（20．70±1．02pg/ml）比較，兩兩差異不顯著（P＞0．05）。

2 光鏡下滑膜及軟骨Mankin’s評(píng)分 見(jiàn)附表。干細(xì)胞治療組無(wú)論健側(cè)還是患側(cè)，其關(guān)節(jié)軟骨及滑膜的Mankin’s評(píng)分均低于對(duì)照組及OA組，差異顯著（P＜0．05）。

附表 光鏡下滑膜及軟骨進(jìn)行Mankin’s評(píng)分

3 滑膜和股骨髁部軟骨光鏡和電鏡檢測(cè)結(jié)果在光鏡下OA組、對(duì)照組患側(cè)可見(jiàn)細(xì)胞壞死，干細(xì)胞治療組患側(cè)鏡下無(wú)明顯的病變。由相應(yīng)的PAS染色可以看出，干細(xì)胞治療組患側(cè)軟骨染色較淺，OA組著色最深，呈鮮紫紅色。對(duì)各組動(dòng)物滑膜光鏡照片比較研究可以看出，干細(xì)胞治療組兩只動(dòng)物可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其余動(dòng)物滑膜均未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。（該炎癥細(xì)胞可能為人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞）。電鏡檢查可以看出，對(duì)照組軟骨細(xì)胞核呈卵圓形，細(xì)胞表面有細(xì)長(zhǎng)突起，胞體及包膜較為完整，胞漿內(nèi)可見(jiàn)許多的細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞周?chē)|(zhì)地松散；OA組軟骨細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)有大量空泡，外形不規(guī)則，細(xì)胞周暈消失，核膜不明顯，細(xì)胞周?chē)鷰缀跷匆?jiàn)其它組織結(jié)果；干細(xì)胞治療組軟骨細(xì)胞的各種細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，染色質(zhì)較均勻，細(xì)胞表面突起基本消失，細(xì)胞內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞漿中有空泡出現(xiàn)，細(xì)胞周?chē)|(zhì)地較為密實(shí)。

討 論

骨關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)的慢性骨關(guān)節(jié)疾病的一種，多因?yàn)楣顷P(guān)節(jié)軟骨面骨質(zhì)增生所致，這種增生具有繼發(fā)性和退行性變的特點(diǎn)。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)不能靈活活動(dòng)和持續(xù)的疼痛感，X射線(xiàn)下關(guān)節(jié)變窄并且會(huì)出現(xiàn)囊化變硬，易發(fā)生骨折，出現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)游離物［3］。骨關(guān)節(jié)炎實(shí)非炎癥，由于多出現(xiàn)退行性病變而稱(chēng)退行性關(guān)節(jié)炎，具體來(lái)說(shuō)是關(guān)節(jié)軟骨部分老化提前，尤其是關(guān)節(jié)部位軟骨的老化。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生意味著關(guān)節(jié)老化發(fā)生，因此骨關(guān)節(jié)炎在中老年人群中的發(fā)病率很高。廣義上講，骨關(guān)節(jié)炎也包括無(wú)菌感染的關(guān)節(jié)炎疾病［4］。

本實(shí)驗(yàn)利用HUCMSCs在骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)腔內(nèi)移植來(lái)探討骨關(guān)節(jié)炎治療的新途徑，間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員之一，干細(xì)胞因?yàn)橛兄匦路只善渌M織的能力，在器官移植及其它疾病治療中具有非常重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞是發(fā)育早期中胚層和外胚層細(xì)胞，最先在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，其多向分化，造血輔助，免疫調(diào)控的特點(diǎn)逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，無(wú)論體內(nèi)還是體外，間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)因素的刺激作用下，可以分化成脂肪、肌肉、骨、韌帶、神經(jīng)、內(nèi)皮組織細(xì)胞等，因而間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為理想的種子，在干細(xì)胞移植治療疾病的進(jìn)程中起到非常重要的作用［5］。

HUCMSCs對(duì)兔關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中IL－1β濃度影響不大，可能與建模均一性較差有關(guān)；從光鏡水平上看，在光鏡下OA組、對(duì)照組患側(cè)可見(jiàn)細(xì)胞壞死，干細(xì)胞治療組患側(cè)鏡下無(wú)明顯細(xì)胞壞死。各組間有顯著的差異性；同時(shí)，從 Mankin’s評(píng)分上看，干細(xì)胞治療組無(wú)論健側(cè)還是患側(cè)，其關(guān)節(jié)軟骨及滑膜的Mankin’s評(píng)分均低于對(duì)照組及OA組；說(shuō)明HUCMSCs有助于骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型損傷滑膜、軟骨的修復(fù)。而從電鏡檢測(cè)結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)干細(xì)胞治療，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物軟骨破壞明顯減輕，軟骨組織受到修復(fù)。電鏡下未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型軟骨組織的修復(fù)機(jī)理可能與移植的間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌作用有關(guān)［6］。本次實(shí)驗(yàn)中模型制作比較成功，但其均一性不是很高，個(gè)體差異較大［7］。本實(shí)驗(yàn)以異種異基因人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)動(dòng)物骨關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行干預(yù)，從光鏡及電鏡檢查結(jié)果無(wú)宿主與移植物的相互排斥反應(yīng)。HUCMSCs的自我更新、多向分化的潛能以及它們所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用，為其臨床應(yīng)用的安全性和有效性提供了可靠的理論依據(jù)，同時(shí)大大擴(kuò)展了其臨床適應(yīng)證的選擇范圍，在骨關(guān)節(jié)病變的治療領(lǐng)域具有廣闊的前景。

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