食品中沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立

黃金海，孫躍輝，陳 瑞，莊世文，劉 瑩，王靜思

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

沙門氏菌是腸桿菌科中一大類重要的食源性致病菌，沙門氏菌引起的中毒病例位居世界各地食物中毒的首位．WHO食源性疾病監(jiān)控計(jì)劃顯示，歐洲每年約有160,000人感染沙門氏菌，大約每 100,000人中有 35人感染[1]，每年用于沙門氏菌的防控和治療費(fèi)用高達(dá)28億歐元[2]．在我國(guó)，70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起，引起沙門氏菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品[3]．沙門氏菌感染畜禽后可引發(fā)一系列疾病，在動(dòng)物屠宰過(guò)程中，腸道中的致病菌會(huì)污染屠宰環(huán)境或被帶到內(nèi)臟與體表，成為畜禽肉胴體、畜禽產(chǎn)品污染的重要來(lái)源[4-5]．衛(wèi)生檢測(cè)要求中，世界各國(guó)普遍規(guī)定食品中不得檢出沙門氏菌．

沙門氏菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法大多采用細(xì)菌分離、生化鑒定表型方法、基于抗體的免疫學(xué)方法等，在快速、敏感與特異性等方面有局限性[6]．PCR法需要昂貴的循環(huán)儀，不適于基層快速檢測(cè)．環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediate isothermal amplification，LAMP)是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它依賴于識(shí)別靶 DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)肉眼觀察，具有高特異性、快速靈敏、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)．自 2000年該技術(shù)開(kāi)發(fā)以來(lái)，LAMP技術(shù)在臨床疾病的診斷、流行性細(xì)菌以及病毒的檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛[7-9]．筆者針對(duì)沙門氏菌侵襲性因子 A基因(invA)設(shè)計(jì)一套 LAMP引物，對(duì) 7種血清型的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化反應(yīng)條件，驗(yàn)證其特異性和靈敏度，并應(yīng)用于食品的檢測(cè)，建立了沙門氏菌檢測(cè)方法．

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株名稱及編號(hào)見(jiàn)表 1，本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存．

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Tab.1 Bacterial strains used in the experiment

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組 DNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)，DNA-LAMP擴(kuò)增試劑盒(榮巖化學(xué)株式會(huì)社，日本)，LA-320CE實(shí)時(shí)濁度儀(榮巖化學(xué)株式會(huì)社，日本)．

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備

(1) 試劑盒法：按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA．

(2) 煮沸法：細(xì)菌純培養(yǎng)物 1,mL于12,000,r/min離心 5,min，加入 100,μL 無(wú)菌水，混勻后，煮沸10,min，冰浴 2,min，12,000,r/min離心 5,min，上清液備用．

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌 invA基因(登錄號(hào)：EU348365)中保守序列，設(shè)計(jì)一套特異性的LAMP引物，包括外引物 F3、B3，2條內(nèi)引物 FIP、BIP和2條環(huán)引物L(fēng)F、BF．引物由Invitrogen公司合成，引物序列見(jiàn)表2．

1.3.3 LAMP反應(yīng)和結(jié)果判定

圖1 LAMP引物設(shè)計(jì)示意Fig.1 Schematic representation of LAMP primer design

表2 擴(kuò)增invA基因的LAMP引物序列Tab.2 DNA oligonucleotide primer Sequence of LAMP for the invA gene

反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液 12.5,μL，Bst DNA 聚合酶 1.0,μL，DNA 模板 2.0,μL，外引物 F3、B3 各5,pmol，內(nèi)引物 FIP、BIP 各 40,pmol，環(huán)引物 LF、BF各20,pmol，最后加入去離子水至總體積為25,μL．混勻后，置于 LA-320CE濁度儀，于 63,℃溫浴60,min，80,℃滅活 2,min．

反應(yīng)過(guò)程中，LA-320CE濁度儀對(duì)反應(yīng)體系的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，每 6,s檢測(cè)一次體系在 650,nm處的吸光度，生成濁度變化曲線，當(dāng)反應(yīng)體系濁度超過(guò)0.25以及濁度的變化速率大于0.1時(shí)，結(jié)果判定為陽(yáng)性．也可通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度變化判定結(jié)果．

1.3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

用建立的 LAMP方法，分別對(duì) 7種不同血清型的沙門氏實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌和空腸彎曲菌作對(duì)照，驗(yàn)證方法的特異性．

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)

基因組 DNA檢測(cè)靈敏度：用試劑盒提取鼠傷寒沙門氏菌(JS1)基因組 DNA并測(cè)定其濃度，10倍倍比稀釋，DNA 原液至 10-1～10-7(體積分?jǐn)?shù)，下同)，各取2,μL 作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)．

細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度：將培養(yǎng)過(guò)夜的鼠傷寒沙門氏菌(JS1)菌液 10倍倍比稀釋至 10-1～10-6，取各稀釋度菌液 100,μL 進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，每組設(shè) 3個(gè)重復(fù)．同時(shí)，取各稀釋菌液 1,mL，用煮沸法提取DNA，取 2,μL上清液作為模板進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增，利用LA-320CE對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)．

1.3.6 食品樣品檢測(cè)

取細(xì)菌培養(yǎng)、常規(guī) PCR沙門氏菌檢測(cè)陰性的豬肉 10,g，無(wú)菌操作置于勻漿機(jī)并加入 90,mL 緩沖蛋白胨水(BP)，制備 1∶10稀釋的均質(zhì)液備用．取10,mL豬肉勻漿液，接入已知濃度的鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)，混勻后作為食品樣品原樣，之后以勻漿液為稀釋液10倍倍比稀釋，37,℃培養(yǎng)12,h后，各取1,mL用煮沸法提取DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增．

2 結(jié) 果

2.1 沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法的建立

以設(shè)計(jì)的一套特異性引物對(duì)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)基因組 DNA進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2．由圖 2(a)可知，以沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)基因組DNA 為模板的擴(kuò)增通道，吸光度大于 0.5，判斷為陽(yáng)性，而以水為陰性對(duì)照的通道未出現(xiàn)擴(kuò)增；由圖2,(b)判定曲線可知，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到 16,min左右時(shí)，通道1濁度的變化速率為0.104，判為陽(yáng)性．結(jié)果表明該引物能夠有效地?cái)U(kuò)增沙門氏菌 invA基因，檢測(cè)時(shí)間約為16,min．

圖2 沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LAMP檢測(cè)結(jié)果Fig.2 LAMP results of Salmonella standard strain

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，僅7株沙門氏菌出現(xiàn)LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他4種菌均無(wú)擴(kuò)增值，檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明該引物特異性強(qiáng)．

圖3 沙門氏菌LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity of Salmonella LAMP assay

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

2.3.1 基因組DNA檢測(cè)靈敏度

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)基因組 DNA濃度為45,ng/μL．10倍倍比稀釋DNA原液進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示基因組DNA檢測(cè)限約為900,fg，見(jiàn)圖4．

圖4 沙門氏菌基因DNA LAMP檢測(cè)靈敏度Fig.4 Sensitivity of Salmonella genomic DNA LAMP assay

2.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度

經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始菌液濃度為 3.36×106,mL-1.10倍倍比稀釋菌液進(jìn)行 LAMP檢測(cè)，結(jié)果該法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限約為3.36×106,mL-1，見(jiàn)圖5．

2.3.3 食品樣品中沙門氏菌的檢測(cè)

采用無(wú)菌的豬肉勻漿構(gòu)建食品樣品模型，加入已知濃度的沙門氏菌培養(yǎng)液，構(gòu)建人工感染的食品原樣模型，使得食品原樣模型中沙門氏菌濃度為 8.25×103,mL-1，亦即模擬食品原樣中沙門氏菌的濃度為8.25×104,g-1．通道 1為豬肉勻漿中加入已知濃度沙門氏菌培養(yǎng)液作為食品原樣，通道2～通道5分別為食品原樣的 10倍梯度稀釋，作為食品樣品，提取DNA進(jìn)行 LAMP檢測(cè)，通道 8為無(wú)菌的豬肉勻漿．結(jié)果見(jiàn)圖 6，通道 1～4均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增，通道5和通道8無(wú)擴(kuò)增，結(jié)果表明該法直接檢測(cè)食品樣品的檢測(cè)限為8.25,g-1．

圖5 沙門氏菌細(xì)菌培養(yǎng)物L(fēng)AMP檢測(cè)靈敏度Fig.5 Sensitivity of Salmonella LAMP assay

圖6 模擬食品樣品中沙門氏菌LAMP檢測(cè)靈敏度Fig.6 Sensitivity of Salmonella LAMP assay in artificially contaminated food

3 討 論

沙門氏菌是一種人畜共患的病原菌，能引起人和動(dòng)物多重共患病，而食源性沙門氏菌污染檢測(cè)主要還是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于在沙門氏菌暴發(fā)流行時(shí)準(zhǔn)確、快速地確定傳染源和傳染途徑，控制其流行．PCR方法敏感、準(zhǔn)確、快速，目前已廣泛用于食品中以及臨床樣品和環(huán)境中的沙門氏菌的檢測(cè)，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測(cè)費(fèi)用以及對(duì)檢測(cè)人員較高的技術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層應(yīng)用．LAMP依賴于能識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，保證了擴(kuò)增的高特異性和高效性，在反應(yīng)過(guò)程中核酸大量合成，從dNTPs析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)副產(chǎn)物-焦磷酸鎂白色沉淀，反應(yīng)體系濁度發(fā)生變化，肉眼可見(jiàn)[10]，不需要昂貴的儀器，只需要一個(gè)恒溫的水浴即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層應(yīng)用．也可以通過(guò) LA-320CE實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)反應(yīng)及終產(chǎn)物的一步檢測(cè)．

引物設(shè)計(jì)對(duì)于建立 LAMP方法非常重要，是檢測(cè)沙門氏菌成功與否的關(guān)鍵．用來(lái)設(shè)計(jì)引物的基因主要分 3類，即屬特異性引物基因、血清群特異性引物基因與血清型特異性引物基因．沙門氏菌的inv基因族具有屬特異性，inv基因族包括 invA、invB、invC、invD和invE等一組系列基因，它們?cè)谏抽T氏菌中廣泛分布，而 invA基因編碼的蛋白在細(xì)菌的致病過(guò)程中起著重要的作用[6,11]．對(duì)沙門氏菌 invA 基因序列分析表明，沙門氏菌屬的不同沙門氏菌菌株的invA基因核苷酸序列存在較高的同源性，BLAST檢索與其他生物無(wú)同源關(guān)系，因此，invA基因是沙門氏菌的主要特征區(qū)域，常作為基因檢測(cè)和鑒定的依據(jù)[12]．本研究選擇與食品安全和公共衛(wèi)生密切相關(guān)的腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌等為研究對(duì)象，選擇 invA基因設(shè)計(jì)引物，對(duì) 7種不同血清型的沙門氏菌都能有效擴(kuò)增，而非沙門氏菌不擴(kuò)增，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)具有沙門氏菌屬特異性，可用于沙門氏菌的檢測(cè)．

與沙門氏菌培養(yǎng)物相比，食品中沙門氏菌的檢測(cè)具有更大的難度．直接用 LAMP檢測(cè)食品中的沙門氏菌面臨的一個(gè)問(wèn)題是不能將活菌和死菌區(qū)別開(kāi)來(lái)．由于檢測(cè)的靈敏性高，即使是樣品中存在死亡沙門氏菌的 DNA也會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果，但死亡沙門氏菌的存在對(duì)食品安全并不構(gòu)成威脅，所以建立能夠區(qū)分死菌和活菌的方法對(duì)沙門氏菌檢測(cè)較為重要．為此，在LAMP檢測(cè)之前，需要選擇性增菌，以減少來(lái)自樣品中死亡沙門氏菌的 DNA的影響，從而增加了檢測(cè)方法對(duì)樣品生物安全評(píng)估的可信度，同時(shí)也提高了食品中沙門氏菌的檢出率．應(yīng)用建立的LAMP方法，液體樣品中沙門氏菌檢出下限為 336,mL-1，而常規(guī)PCR 的檢出線一般在 103～105,mL-1活菌水平[13]．應(yīng)用建立的LAMP方法，經(jīng)增菌培養(yǎng)程序后，可檢出含菌量為8.25,g-1的陽(yáng)性肉品．

應(yīng)用LAMP方法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，方法特異、敏感，可有效檢測(cè)樣品中的沙門氏菌；檢驗(yàn)周期短，每一批樣品從樣品準(zhǔn)備到檢出只需要2,h，如果將增菌時(shí)間計(jì)算在內(nèi)，也僅需要15,h；操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，不需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，可適應(yīng)國(guó)境口岸方便快捷的需要，在基層檢測(cè)中易于推廣，具有較高的實(shí)用價(jià)值．

4 結(jié) 語(yǔ)

應(yīng)用所建立的 LAMP方法檢測(cè)沙門氏菌 invA基因，在檢出時(shí)間、靈敏度方面優(yōu)于其他血清學(xué)及PCR方法，通過(guò)富集增殖后進(jìn)一步提高了靈敏度和檢出率，降低了復(fù)雜食品原料對(duì)檢出率的影響，LAMP方法還可通過(guò)眼觀進(jìn)行判定，適用于基礎(chǔ)應(yīng)用．沙門氏菌 invA基因檢測(cè)的 LAMP方法，可作為動(dòng)物沙門氏菌感染、進(jìn)出口檢疫、食品及其原料中沙門氏菌污染快速檢測(cè)及其安全性評(píng)價(jià)的手段．

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