養陰柔肝活血法對大鼠酒精性肝纖維化肝星狀細胞PDGF 及其受體表達的影響

趙鯤鵬

本實驗旨在探討養陰柔肝活血法與活化的肝星狀細胞分泌的PDGF及其受體PDGFR的相關性，進而闡明其抗酒精性肝纖維化的作用機制。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重200±20g，購自甘肅中醫學院實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥品和主要試劑 養陰柔肝活血法方藥制劑由甘肅中醫學院附屬醫院制劑室根據配方制作而成;白酒(乙醇)為北京釀酒總廠出品的56度紅星牌二鍋頭白酒;橄欖油由上海中秦化學試劑有限公司提供;鱉甲煎丸為武漢中聯藥業集團股份有限公司產品，國藥準字z42020772;吡唑為新沂市匯力精細化工有限公司產品;高脂飼料由北京科澳協力飼料有限公司根據配方(87.5%基礎飼料+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽鹽)生產;PDGF_BB及PDGFR_β試劑盒由西安科昊生物工程有限責任公司提供;四氯化碳由煙臺市雙雙化工有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 造模方法與分組處理 首先制備“乙醇-橄欖油-吡唑”混懸液［60%酒精8ml/(kg·d)］、橄欖油2ml/(kg·d)、吡唑25mg/(kg·d)］，CCl4橄欖油注射液(CCl4∶橄欖油=1∶3);對大鼠進行混懸液灌胃，并間斷飼高脂飼料，結合微量CCl4腹腔注射的復合模式造酒精性肝纖維化病理模型，造模方法參照文獻［1］并略加改進。60只Wistar雄性大鼠適應性喂養3天后隨機分為6組，即正常組10只，造模組50只。①正常組:大鼠普通喂養，生理鹽水灌胃10ml/(kg·d)×12周;第2周起予以0.3 ml/kg劑量的生理鹽水腹腔注射，每周2次，至第8周末結束。②造模組大鼠酒精混懸液灌胃，第1周6ml/(kg·d)，第 2周 8ml/(kg·d)，第 3 周 10ml/(kg·d)，以后維持此量，直至造模8周末結束。另外第2周起按0.3ml/(kg·d)劑量腹腔注射微量CCl4橄欖油溶液，2次/周，至第8周末結束;同時隔周間斷性飼喂高脂飼料。③第8周末造模組50只大鼠隨機分為5組，即模型組、鱉甲煎丸治療組、養陰柔肝活血法高、中、低劑量治療組，每組10只。④各治療組于造模8周后給藥，1次/日，每天同一時間灌胃，連續4周，分別根據大鼠具體體重確定藥量(按體重換算)，每(3～4)日稱體重后調整劑量。

養陰柔肝活血方藥物制備方法:麥冬15g，當歸15g，柴胡12g，白芍 10g，枳實 10g，梔子 10g，枳椇子 10g，黃芪 12g，炙鱉甲10g，丹參12g，蒼術10g，白寇10g，茯苓15g。每劑藥頭煎加水500ml，煮取300ml;二煎加水300ml，煮取200ml;兩煎相合，去渣再煎至400ml。所有藥物均購自甘肅中醫學院附屬醫院中藥房，由甘肅中醫學院附屬醫院制劑室研究室加工成中藥浸膏(每克浸膏相當于生藥3.28g)，4℃貯存備用，用前按比例生理鹽水稀釋。

用藥劑量:參考人的臨床用量確定小、中、大3個灌胃給藥劑量。養陰柔肝活血方中藥浸膏(3.28g)，人臨床生藥量1g/(kg·d)，人臨床生藥量的5倍即為大鼠灌胃量的中劑量［5g/(kg·d)］，經計算調養陰柔肝活血方大鼠灌胃中劑量為1.5g/(kg·d)中藥浸膏，小劑量為0.75g/(kg·d)中藥浸膏，大劑量為3.0g/(kg·d)中藥浸膏，相當于人臨床給藥量的5倍，2.5倍，10倍，中藥對照藥(鱉甲煎丸)灌胃給藥量為0.25g/(kg·d)，相當于人的臨床用量的5倍，模型組予生理鹽水10ml/(kg·d)灌胃，治療時間為4周。

1.2.2 收集標本 實驗第12周末，均于末次給藥后24小時，禁食12小時，動物斷頸處死。統一留取大鼠肝左葉組織，加入一定量的PBS(pH7.4)，冰浴中制成肝組織勻漿。離心3000轉/分×20分鐘。收集上清液，分裝待測。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 大鼠PDGF檢測方法 嚴格按照大鼠PDGF檢測試劑盒說明書要求操作。具體操作步驟如下:①提前20分鐘將試劑盒取出放置在室溫下。②從已平衡至室溫的密封袋中取出板條。③標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔14孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九、第十孔中各取50μl分別加到第十一、第十二孔中，再在第十一、第十二孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第十一、第十二孔中分別取50μl加到第十三、第十四孔中，再在第十三、第十四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第十三、第十四孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為36ng/L，24ng/L，12ng/L，6ng/L，3ng/L，1.5ng/L，0.75ng/L)。④加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后將所有實驗組大鼠肝組織勻漿液加入到相應的孔中，每孔加入10μl，輕輕晃動混勻。⑤溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。⑥ 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。⑦洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。⑧加酶:每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。⑨溫育:操作同3。⑩洗滌:操作同5。? 顯色:每孔先加入顯色劑 A 50μl，再加入顯色劑 B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。? 終止:每孔加終止液50μl，終止反應。?測定:以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。?標準品制定標準曲線，根據標準曲線獲得每只大鼠肝組織勻漿液中具體的PDGF濃度。

1.2.3.2 大鼠PDGFR檢測方法 具體操作如大鼠PDGF檢測步驟，只是標準品的稀釋與加樣后，濃度分別為1200ng/L，800ng/L，400ng/L，200ng/L，100ng/L，50ng/L，25ng/L。

2.結果

養陰柔肝活血法對酒精性肝纖維化大鼠肝臟HSC中PDGF及PDGFR相對濃度的影響，見表1。

實驗結果顯示，模型組PDGF及PDGFR平均濃度顯著高于正常組及養陰柔肝活血法高、中劑量組，差異有極顯著統計學意義(P＜0.001);鱉甲煎丸組、養陰柔肝活血法低劑量組PDGF及PDGFR平均濃度均顯著低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05);養陰柔肝活血法中劑量組PDGF及PDGFR平均濃度明顯低于鱉甲煎丸組，差異有統計學意義(P＜0.05);養陰柔肝活血法高、低劑量組與鱉甲煎丸組比較，差異無統計學意義(P＞0.05);養陰柔肝活血法中劑量組降低PDGF及PDGFR的效果優于高、低劑量組。

表1 各組PDGF及PDGFR的平均濃度

3.討論

PDGF是目前已知的HSC最強的促分裂素，以激活HSC并促進其增殖、轉化為主，也可促進其產生膠原［2］。PDGF必須與細胞膜上的相應受體結合后才能發揮其生物學效應，PDGF受體由兩種亞單位α及β構成，激活的HSC才表達β亞單位［3］。國內外研究者普遍認為PDGF-BB及PDGFR-β在肝纖維化過程中的作用尤為突出。故了解PDGF及PDGFR在酒精性肝病的發生發展中的表達變化，將有助于解釋酒精性肝纖維化的發病機制及中藥治療該病的療效機理。基于以上理論，我們選取PDGF及PDGFR研究對象，通過探索養陰柔肝活血法抑制肝纖維化形成過程中PDGF及PDGFR的變化，以期為養陰柔肝活血法的靶向作用提供理論依據。結果顯示PDGF及PDGFR在各治療組的表達較模型組減少，且均有顯著性差異。提示降低PDGF及PDGFR在肝組織中的表達，從而抑制HSC的激活、增殖以及細胞外基質的合成，可能是養陰柔肝活血法發揮抗肝纖維化作用機制之一。

1 楊華，張麗軍，馮艷玲，彭秀華，周文江.酒精復合性肝纖維化大鼠模型的建立及動態觀察［J］.實驗動物與比較醫學，2008，28(4):234-237.

2 LI RONG，ZHAO MENYUN.Effects of Astragalus herb soup on expression of TGF- β1，CTGF and PDGF-BB in experimental hepatic fibrotic rats［J］.Proceeding of clinical medicine，2006，15(9):659-661.

3 Wong L，Yamasaki G，Johnson RJ，Friedman SL.Induction of betaplatelet-derived growth factor receptor in rat hepatic lipocytes during cellular activation in vivo and in culture.J Clin Invest 1994;94:1563-1569.