超聲破碎變異鏈球菌后蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化研究

劉 果，何永紅，萬呼春，鐘曉波，齊 進(jìn)△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院400015；2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川大學(xué)，成都610041；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院內(nèi)科，成都610041）

變異鏈球菌（streptococcus mutans，以下簡稱變鏈菌）屬革蘭陽性球菌，以其較強(qiáng)的產(chǎn)酸、耐酸及黏附能力成為牙菌斑生物膜中的優(yōu)勢(shì)菌，是導(dǎo)致齲病的重要致病菌之一［1］。目前，已有研究表明，多種藥物成分可有效抑制變鏈菌生長，但具體作用機(jī)制未知。雙向電泳（two－dimensional electrophoresis，2DE）作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，能夠?qū)f種蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離，動(dòng)態(tài)分析細(xì)菌蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，在研究致齲機(jī)制、藥物抑菌機(jī)制等方面具有重要意義［2－4］。而如何增大樣品蛋白質(zhì)的提取量并提高其溶解度是蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵步驟［5］。超聲法破碎細(xì)菌提取樣品蛋白質(zhì)是常用方法，本研究采用超聲法破碎細(xì)菌，并對(duì)如何提高蛋白質(zhì)的提取效率進(jìn)行研究，為開展變鏈菌的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行探索，為變鏈菌致齲機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 變異鏈球菌ATCC25175（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），TPY培養(yǎng)基，裂解液（30 mmol/L Tris－Hcl，7mol/L脲，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%DTT，5mmol/L PMSF），RC DC 蛋白定量試劑盒（BIO－RAD公司，美國），超聲破碎儀（Sanyo公司，日本），微型垂直電泳系統(tǒng)和BIO－RAD 2000凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO－RAD 公 司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及收集 細(xì)菌復(fù)蘇后接種TPY瓊脂平板，37℃兼性厭氧（80%N2，10%H2，10%CO2）培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種TPY液體培養(yǎng)基，37℃兼性厭氧培養(yǎng)18h，收集菌懸液。4℃12 000×g離心10min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用含氯霉素（100μg/mL）雙蒸水洗滌2次后重懸于不含氯霉素的雙蒸水中。調(diào)整菌懸液Mcf（麥?zhǔn)现担?.8左右，濃縮40倍后將菌懸液按每管1mL分裝于離心管中，4℃12 000×g離心10 min，收集菌沉淀，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 超聲破碎菌體 取－20℃保存的菌沉淀，加入裂解液1mL，冰浴條件下采用超聲法（超聲功率300～350W，工作9.9s，間歇9.9s，循環(huán)152次）裂解細(xì)菌。超聲結(jié)束時(shí)將菌懸液振蕩混勻。

1.2.3 掃描電鏡觀察裂解前、后菌體形態(tài) 分別取等量裂解前和裂解后菌懸液。將細(xì)菌懸液與等量5%戊二醛混合，4℃固定過夜。經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）液（pH7.2）洗3次，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為108～107CFU。取10μL滴于1cm×1cm大小載玻片上，50℃干燥10min使細(xì)菌固定。30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%梯度乙醇梯度脫水各10min，由醋酸異戊酯浸泡2h。常規(guī)臨界點(diǎn)干燥，鍍金，掃描電鏡觀察樣本。

表1 放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)樣本吸光度A值（s，CV，n＝3）

表1 放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)樣本吸光度A值（s，CV，n＝3）

0min 10min 30min 50min 70min平行樣.84 2.18 2.03 4.87 0.93 2.89

1.2.4 提取不同放置時(shí)間點(diǎn)菌懸液蛋白 將超聲破碎后的菌懸液分裝于1mL滅菌EP管中，分別編號(hào)為a、b、c、d、e，對(duì)應(yīng)室溫中放置時(shí)間0、10、30、50、70min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)平行管。放置時(shí)間結(jié)束后，各管分別振蕩混勻，然后4℃16 060×g離心10min，取上清液進(jìn)行分析。

1.2.5 SDS－PAGE測(cè)定不同放置時(shí)間蛋白質(zhì)構(gòu)成的差異 按《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》制備SDS－PAGE，濃縮膠為5%，分離膠為12%。取各時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)提取液20uL，分別加入上樣緩沖液混勻制成電泳樣本。將電泳樣本注入SDS－PAGE加樣孔中，濃縮膠80V電泳30min，分離膠120V電泳90min停止。考馬斯亮藍(lán)染色30min，再用脫色液脫色至背景清晰。每個(gè)電泳樣本重復(fù)2孔，電泳及染色重復(fù)3次。凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并采集圖像。

1.2.6 RC DC法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)濃度

1.2.6.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列配制 稱取一定量BSA溶解于提取液對(duì)照中，配制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0和1.5mg/mL。

1.2.6.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 從各時(shí)間點(diǎn)的上清液中分別取25μL于EP管。按照RC DC試劑盒說明操作，取最終的反應(yīng)液200μL于96孔板中，在750nm波長處測(cè)定每孔的吸光度值（A）。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌破碎程度分析 未處理的變鏈菌收集后互相重疊呈團(tuán)聚狀，數(shù)量多，密度大，如圖1A所示。高倍鏡下觀變鏈菌菌體形態(tài)完整飽滿，在同一平面上分裂并相互粘連，如圖1B所示。超聲處理后絕大部分細(xì)菌破碎成絮狀碎片，僅見極少量破裂不完全和形態(tài)完整的細(xì)菌，如圖1C、D所示。

2.2 放置時(shí)間對(duì)提取蛋白質(zhì)構(gòu)成成分的影響 圖2為裂解后從放置不同時(shí)間后的菌懸液中提取的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由圖顯示放置不同時(shí)間后裂解液中的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS－PAGE分離后的條帶分布完全一致，同時(shí)條帶豐度也無明顯差異。

2.3 放置時(shí)間對(duì)提取蛋白質(zhì)濃度的影響 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝0.118 9 X－0.002，相關(guān)系數(shù)為 0.996 1，其中 X為蛋白質(zhì)濃度，Y為吸光度值。各時(shí)間點(diǎn)上清液樣本的3個(gè)平行孔的變異系數(shù)CV（%）范圍在0%～2.9%之間。各時(shí)間點(diǎn)4個(gè)平行樣本吸光度值變異系數(shù)CV（%）范圍為0.93%～4.87%之間，結(jié)果見表1。各時(shí)間點(diǎn)上清液的蛋白質(zhì)濃度見圖3所示。由圖可見，超聲結(jié)束后室溫放置30min時(shí)裂解液中蛋白質(zhì)含量最高。對(duì)5組進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示放置30min和70min時(shí)裂解液中的蛋白質(zhì)含量均高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，放置30min時(shí)裂解液中的蛋白質(zhì)含量顯著高于70min時(shí)（P＜0.05）；而放置0、10和50min的裂解液中的蛋白質(zhì)含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 超聲裂解前、后的變鏈菌形態(tài)

圖2 裂解后放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)SDS－PAGE圖譜

圖3 放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)樣本質(zhì)量濃度

3 討 論

變異鏈球菌屬于革蘭陽性菌，細(xì)胞壁厚且堅(jiān)韌難以破碎，一般采用的破碎方法有反復(fù)凍融結(jié)合超聲法、氧化鋁粉末混合研磨法、玻璃珠勻漿法以及高壓法等［6－8］。超聲波破碎法是目前提取細(xì)菌蛋白時(shí)常用的技術(shù)手段［9－10］。Thongboonkerd等［11］研究認(rèn)為僅通過超聲即可使化膿性鏈球菌達(dá)到80%的破碎，但無明確評(píng)價(jià)細(xì)菌破碎程度的指標(biāo)。超聲破碎法在大大提高蛋白質(zhì)提取效果的同時(shí)，還能增加蛋白質(zhì)的溶解性［12］，且可避免外源性蛋白質(zhì)對(duì)樣本的污染［13］。已有實(shí)驗(yàn)表明超聲破碎變鏈菌效果明顯［9，14］，而在變鏈菌蛋白質(zhì)組研究中，如何提取樣本的最大量對(duì)結(jié)果至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)將超聲破碎結(jié)束的變鏈菌菌懸液分別放置不同時(shí)間，在菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)充分溢出并溶解后，對(duì)其中的蛋白進(jìn)行構(gòu)成及量的測(cè)定，探索放置時(shí)間對(duì)菌懸液中蛋白質(zhì)提取效率的影響。SDS－PAGE電泳可根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同分離混合蛋白質(zhì)，是分析各蛋白質(zhì)構(gòu)成變化的有效手段［14］。本實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果顯示，超聲后放置不同時(shí)間的菌懸液中蛋白質(zhì)的條帶分布及豐度基本相同，提示放置時(shí)間對(duì)菌懸液中蛋白質(zhì)的構(gòu)成無明顯影響，但對(duì)濃度的影響無法通過SDS－PAEG電泳精確展示。本實(shí)驗(yàn)采用的RC DC試劑盒法以Lowry法為基礎(chǔ)，并能夠兼容裂解液中多種試劑成分，同其他蛋白質(zhì)定量測(cè)定方法相比，具有精密度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)［15－16］。定量結(jié)果表明，超聲破碎后放置30min的菌懸液中蛋白質(zhì)的濃度最高；放置時(shí)間少于30min的菌懸液，隨時(shí)間的延長蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，而超過30min所提取的蛋白質(zhì)隨時(shí)間的延長濃度下降。

經(jīng)掃描電鏡觀察，大部分細(xì)菌破裂后呈絮狀碎片，極小部分細(xì)菌呈現(xiàn)清晰的殘余菌體形態(tài)，個(gè)別變鏈菌菌體較為完整。提示胞壁破裂完全的細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)已充分外流，蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的釋放較徹底。而形態(tài)完整的細(xì)菌胞壁上可能存在有較小的裂口，猜測(cè)它們和存在殘余菌體的變鏈菌胞內(nèi)物質(zhì)的釋放需要一定時(shí)間完成。在測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度時(shí)，需保證菌體內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)充分溶解于提取介質(zhì)中。而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的釋放量少，或出現(xiàn)蛋白降解、沉淀等情況時(shí)，即導(dǎo)致提取介質(zhì)中蛋白質(zhì)的溶解減少，使測(cè)量濃度偏低。本實(shí)驗(yàn)采用的提取液中含有的脲和硫脲等可以充分破壞蛋白質(zhì)之間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集。還原劑DTT能夠幫助打開蛋白質(zhì)的二硫鍵，促進(jìn)半胱氨酸殘基被還原，使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。而蛋白酶抑制劑PMSF可有效抑制細(xì)菌自身所釋放的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解。由數(shù)據(jù)可看出，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與裂解后放置時(shí)間在0～30min范圍內(nèi)成正相關(guān)。由此提示，一方面，蛋白質(zhì)的釋放可能隨時(shí)間的延長增加；另一方面，提取介質(zhì)中復(fù)雜的試劑成分與蛋白質(zhì)、水解酶的相互作用可能并沒有伴隨裂解過程的結(jié)束而終止，而在裂解后的一段時(shí)間內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行。同時(shí)，蛋白酶抑制劑PMSF主要抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，而菌體內(nèi)釋放的其他蛋白酶可能仍存在活性，它們?cè)谌芙夂笈c蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度的降低。但放置30～70min與蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性無明顯規(guī)律，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。

［1］周學(xué)東，肖曉蓉.口腔微生物學(xué)［M］.成都：四川大學(xué)出版社，2002：12－28.

［2］Hrimech M，Mayrand D，Grenier D，et al.Xylitol disturbs protein synthesis，including the expression of HSP－70and HSP－60，in Streptococcus mutans［J］.Oral Microbiol Immunol，2000，15（2）：249－257.

［3］Visith TH，Jirapon L，Junkai C，et al.Fluoride exposure attenuates expression of streptococcus pyogenes virulence factors［J］.J Biolog Chem，2002，277（19）：16599－16605.

［4］Brighenti，Luppens.Effect of psidium cattleianum leaf extract on streptococcus mutans viability，protein expression and acid production［J］.Caries Res，2008，42（2）：148－154.

［5］談旭翡，陳智.蛋白質(zhì)組學(xué)研究中雙向電泳樣本的制備［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2008，5（5）：462－465.

［6］Wilkins JC，Homer KA，Beighton D.Analysis of streptococcus mutans proteins modulated by culture under acidic conditions［J］.Appl Environ Microbiol，2002，6（15）：2382－2390.

［7］Welin J，Wilkins JC，Beighton D，et al.Effect of acid shock on protein expression by bioflm cells of streptococcus mutans［J］.FEMS Microbiol Letters，2003，227（2）：287－293.

［8］牛屹東，馮捷，崔恒，等.蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006：1－13.

［9］何永紅，田曉蓓，萬呼春，等.變異鏈球菌蛋白提取方法研究［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，27（1）：100－103.

［10］Alice C，Len L.Harty DW.Stress－responsive proteins are upregulated in streptococcus mutans during acid tolerance［J］.Microbiology，2004，150（11）：1339－1351.

［11］Thongboonkerd V，Luengpailin J，Cao JK，et al.Fluoride exposure attenuates expression of streptococcus pyogenes virulence factors［J］.J Biol Chem，2002，19（277）：16599－16605.

［12］Ca?as B，Pi?eiro C，Calvo E，et al.Trends in sample preparation for classical and second generation proteomics［J］.J Chromatogr A，2007，1153（2）：235－258.

［13］Rathsam C，Eaton RE，Simpson CL，et al.Two－dimensional fluorescence difference gel electrophoretic analysis of streptococcus mutans biofilms［J］.J Proteome Res，2005，4（6）：2161－2173.

［14］田曉蓓，韓建國.超聲時(shí)間對(duì)提取變異鏈球菌蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（8）：527－529.

［15］Mey MD，Lequeux GJ，Maertens J，et al.Comparison of protein quantification and extraction methods suitable for E.coli cultures［J］.Biologicals，2008，36（3）：198－202.

［16］Okutucu B，Din?e A，Habib?，et al.Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration［J］.J Biochem Biophys Methods，2007，70（5）：709－711.