他克莫司血藥濃度監測中質控分析評價

郝堂娜，孫 玲，李 鎮，張 寧，張 策，聶維廷

他克莫司(Tacrolimus，FK506)是日本藤澤研發的23元環狀大環內酯類新型免疫抑制劑，通過拮抗相關多細胞因子的產生和表達來抑制T細胞活化［1-2］，具有急性排斥反應發生率低、對類固醇激素相對無依賴性等優點。但其治療窗窄，生物利用度個體差異大，同時存在很多不良反應［3-4］，因此，對FK506進行治療藥物監測(TDM)非常必要［5-6］。本文采用酶聯免疫吸附法(ELISA)進行血藥濃度測定，并對2007年6月-2010年7月FK506血藥濃度監測過程中的隨行質控數據進行回顧性分析，確保他克莫司血藥濃度測定結果的準確性。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 PRO-TracⅡTMTacrolimus ELISA試劑盒(美國 Diasorin公司生產):①酶標板;②FK506單克隆抗體;③5×濃縮辣根過氧化酶儲存液;④酶標稀釋液;⑤標準品(濃度分別為:0.3、1.0、3.0、10、30 ng/mL);⑥低、高質控對照品1、2;⑦底物液;⑧終止液;⑨10×洗滌液;⑩消化液。

1.2 儀器 酶標儀(美國Universal Microplae Reader EL×800NB)，Adoff管(江蘇海門天星塑料制品廠)，HH-W21-420S數顯電熱顯溫水溫箱，SK-1快速混勻器(江蘇醫療儀器廠)，LG15-W 離心機(北京醫用離心機廠)，他克莫司定量測定試劑盒(酶聯免疫法，美國Diasorin公司)，低速自動平衡離心機 LDZ5-2(北京醫用離心機廠)，Stat Fax-2200孵育振蕩儀(美國Awareness公司)。

2 方法

2.1 標準曲線的建立 建立5個點的標準曲線，標 準 品 濃 度 分 別 為 0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 ng/mL，并隨行兩個濃度質控樣品 2.0、15.0 ng/mL。取標準系列樣品、質控對照樣品各25μL放入1.5mL Adoff管，加入150μL 消化液，渦旋30 s，室溫下靜置15min，然后放入75℃水浴箱中靜置15min。取出渦旋30 s，4500 r/min離心10min，分別取上清液100μL加入酶標板，除空白對照管外，每管加50μL FK506單抗，空白對照管加50μL酶標稀釋液，用薄膜覆蓋酶標板放入溫育震蕩器，(700±50)r/min置37℃震蕩30min。取出加酶標液50μL(用酶標稀釋液5倍稀釋酶標濃縮液)，震蕩60min(條件同前)。取出洗板3次(用蒸餾水將洗滌緩沖液按1∶10稀釋)，然后每管加200μL底物液，震蕩15min(條件同前)。再加入100μL終止液，在450/630 nm下測定吸光度，記錄數據，繪制吸光度對濃度的標準曲線［7］。

2.2 FK506質控樣品血藥濃度測定 監測全血中FK506血藥濃度，同時監測低、高兩個質控樣本濃度 C1、C2(ng/mL)，測定方法同“2.1”項方法。

2.3 數據分析方法 采用SPSS 11.5統計學軟件分別對2007年6月-2010年7月期間的質控數據進行統計學分析，并繪制質控曲線。

2.4 繪制質控圖和設定控制限 在監測臨床樣品血藥濃度同時隨行質控測定，并記錄結果。以2007年6月-2010年7月監測質控的單次測定結果為研究對象，對獲得的FK506低、高濃度質控測定結果C1、C2(ng/mL)進行回顧性分析，計算出平均值(X)、標準差(SD)和相對標準偏差(RSD)。以X為靶值，SD的倍數為控制限，即質控品測定值在X±2SD之間為質控結果在控，以X±2SD為警告限、X±3SD為失控限。以靶值為中心線，以測定批次為橫坐標，以濃度測定結果為縱坐標，標出各條控制限，繪制FK506血藥濃度監測的Levey-Jennings質控圖。

3 結果

3.1 標準曲線的繪制 以吸光度對濃度進行線性回歸，得標準曲線 Y=1.9668/［1+(X/3.697)^1.381］+0.4602，r=0.9996，如圖1 所示。FK506在0.3～30μg/mL的范圍內，線性關系良好。

圖1 酶聯免疫吸附法測定FK506標準曲線

3.2 統計學分析結果 對2007年6月-2010年7月隨行低、高質控的單次測定結果分別進行單向方差檢驗。結果表明，在不同時間段內對低質控的測定結果差異有統計學意義(P＜0.05)，而對高質控的測定差異無統計學意義(P＞0.05)，結果見表1。

表1 2007年6月-2010年7月高、低質控處理結果

3.3 levey-Jennings質控圖分析結果 2007年6月-2010年 7月測得質控 269份，其中 C1(2.0 ng/mL)134份，C2(15 ng/mL)135份，質控周期內隨行質控樣本RSD分別為3.85%、4.89%、4.80%。繪制單濃度Levey-Jelmings質量控制圖，測定結果均“在控”，結果見表2。低濃度質控誤差允許范圍(X±2SD)為1.15～3.29 ng/mL，測定值范圍為1.72～2.63 ng/mL，而高濃度質控誤差允許范圍(X±2SD)為10.50～21.55 ng/mL，測定值范圍為13.92～17.10 ng/mL，可見高、低質控均在質控警告限范圍內，結果見圖2、圖3。

表2 Levey-Jelmings質控圖與標準質控范圍結果比較

圖2 質控C1(ng/mL)濃度Levey-Jennings質控圖

圖3 質控C2(ng/mL)濃度Levey-Jennings質控圖

4 討論

4.1 FK506藥物濃度監測方法的選擇 FK506在全血中分布遠遠高于血漿，因此，測定FK506全血血藥濃度檢測靈敏度高，結果更可靠。目前，FK506全血血藥濃度測定的常用方法有ELISA、微粒酶免疫分析法(MEIA)、高效液相色譜法(HPLC)法、高效液相色譜-質譜聯用(HPLC/MS)法和酶增強免疫分析法(EMIT)［8］。本試驗選擇ELISA法，其靈敏度高，特異性好，設備簡單，操作方便，結果易判斷。試劑盒附帶標準品和低、高兩個質控品，測定時只需滿足低、高質控樣品“在控”，即可保證結果的準確性。盡管質控允許的誤差范圍比一般TDM質控允許誤差范圍大，但由于其測定過程中試驗步驟多、周期長，測定人員不固定，測定結果易受溫度等外界因素干擾，所以，儀器的維護和校準是保證結果準確的前提。此外，試劑盒、質控盒、標準曲線盒應置于冰箱保存，無變質、過期，從而保證為臨床提供準確的測定結果，以制定合理的個體化給藥方案。

4.2 FK506藥物濃度監測隨行質控分析 目前，常規FK506血藥濃度監測質量控制采用定期或每次測定樣本時隨行測定質控樣本，只要質控樣本的測定結果落在說明書允許的誤差范圍內，則判斷此測定結果可靠［9］。這種判斷標準忽略了評價的連續性，不能及時發現影響測定準確性的潛在因素。此外，也有采用SPSS統計軟件質控程序，其主要用于處理每日多點質控數據，對本實驗數據的處理有一定局限性。本試驗采用室內單值質控法，即Levey-Jennings質控法，通過回顧性計算均值及標準差，以X±2S為警告限，以X±3S為失控限，繪制指控圖。每次僅需監測一次質控樣品，用室內質控圖對監測結果可靠性進行判斷，即室內質控“失控”時未查明原因前監測結果不宜發出，室內質控“在控”時，方可發出監測結果［10］。在實際監測中及時繪制質控圖，根據質控圖對監測結果加以判斷。若質控測定存在漂移、趨勢性變化，則立即分析出現這種定向趨勢的原因，排查誤差并分析可能存在的影響因素并及時糾正，以確保提供準確可靠的血藥濃度測定結果。本文回顧分析了近2年的質控監測結果，通過繪制質控圖，發現低、高質控結果均在警告限范圍內，且在中心線兩側規律波動，未出現定向改變的趨勢，表明每次的TDM監測結果準確可靠，具有臨床指導意義。

5 小結

本文對2007年6月-2010年7月FK506血藥濃度監測過程中的隨行質控數據進行了回顧性分析，對其進行單向方差分析，繪制Levey-Jennings質控圖。結果表明，2007年6月-2010年7月隨行的質控分析結果均“在控”，質控結果均在誤差允許范圍內，說明FK506血藥濃度監測結果數據可靠，準確度高，具有較好的臨床指導意義。

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