白僵菌RAPD－PCR反應體系優化1)

魏曉鵬 李會平 黃大莊 唐秀光

(河北農業大學，保定，071000)

近年來，隨著國家大力倡導林業生產的可持續發展，在林業病蟲害防治中，生物防治越來越受到重視。白僵菌(Beauveria bassiana)作為當前世界上研究和應用最多的一種廣譜蟲生真菌，其致病力強，殺蟲譜廣，對溫血動物和植物無害且容易培養。我國南至海南、北抵黑龍江都有白僵菌的分布，應用白僵菌防治農、林害蟲的種類和面積均居世界首位，防治害蟲種類達40種以上，年防治面積達67萬hm2，在控制森林害蟲的嚴重發生和減少環境污染方面，發揮著不可替代的作用［1］。然而在研究和應用過程中，菌株繼代培養一定代數后經常出現生產性狀的退化，如產孢量減少、殺蟲毒力降低等。目前對菌株退化的研究主要集中在菌落局變、產孢量、殺蟲毒力變化等宏觀方面的研究，關于菌株退化的原因，自1974年Yurchenko首次報道球孢白僵菌具有異核現象，張志光進一步證實其在自然界以異核體形式存在后，許多學者據此推測，由于異核體不穩定，在人工培養基上的培養過程中，異核體內核比例不斷變化，比較適用培養基腐生條件類型的核被選擇出來占優勢，但這種類型對昆蟲致病力不一定強，由此導致菌種毒力發生改變［2－3］。王成樹等［4］采用分子標記方法驗證了球孢白僵菌的異核現象。唐曉慶等［5］認為白僵菌在繼代培養中發生的菌落局變現象與白僵菌在生產和應用過程中常見的退化現象基本一致。其他關于白僵菌退化的遺傳學研究還鮮見報道，這就大大限制了利用生物工程技術控制菌種退化工作的進行。基因組DNA的提取和PCR反應是遺傳學研究的前提，因此筆者在基因組DNA提取的基礎上，對白僵菌RAPD反應體系及反應條件進行探索，旨在找到適宜于白僵菌退化遺傳學研究的一套完整的RAPD－PCR反應體系及反應程序。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:球孢白僵菌Bb00菌株，由河北農業大學林學院林木病理實驗室提供。

菌體制備:將1×108/mL的白僵菌孢子懸浮液，涂布于鋪有玻璃紙的PDA平板培養基上，恒溫培養箱中25℃無光照培養5 d后刮取干菌絲，放入冰箱中－20℃保存備用。

主要試劑:隨機引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，4種dNTP、5 UTaqDNA聚合酶、DL2000 ladder marker均購于 Promega公司，Gold－View和瓊脂糖購于北京索萊寶科技有限公司，DNA提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(DV811))購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

基因組DNA提取:白僵菌基因組DNA提取按照試劑盒提供的說明書操作步驟進行。

RAPD－PCR正交組合優化設計:參照李增智等［6］，引物選用 P25(5＇－AACGGTGACC－3＇)，由上海生工生物工程有限公司合成。采用L16(45)正交試驗設計，在20 μL反應體系中，選擇 Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA 5種因素，每個因素設4個水平(表1)。RAPD－PCR反應程序為94℃ 預變性2 min，94 ℃ 變性30 s，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環共40次，72℃延伸5 min。PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上(含GoldViewTM核酸染料)電泳分離，紫外凝膠成像系統下觀察并照相。DNA marker采用DL2000 DNA ladder分子質量標準。RAPD反應程序主要參照韓小勇等［7］的方法。

表1 RAPD－PCR反應體系各組分加樣量

RAPD－PCR反應的退火溫度和循環次數優化設計:確定RAPD－PCR反應體系最優組合之后，對RAPD－PCR反應程序中的退火溫度和循環次數分別進行單因素梯度優化，并分析比較2個因素對擴增反應的影響。退火溫度設計 30、32、34、36、38、40、42℃ 7個梯度;循環次數設計35、40、45次3個梯度。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取效果

用DNA提取試劑盒(DV811)提取白僵菌基因組DNA的凝膠電泳圖譜完整性較好，條帶整齊明亮(圖1)，無降解，說明提取的DNA質量較好，適合用于RAPD－PCR擴增。

圖1 白僵菌基因組DNA的凝膠電泳圖譜

2.2 白僵菌RAPD－PCR反應體系的正交設計組合

從圖2可以看出，在正交設計的16個組合中各組合之間擴增的結果表現出一定的差異性。在16個組合中6、11和13號組合未擴增出條帶，1、2、5、12、15、16號組合擴增的條帶較模糊且不穩定，3、4、7、8、9、10、14 號組合擴增的條帶均較清晰，但以 4號組合擴增的結果最清晰、條帶數最多且穩定性很好。因此，確定白僵菌RAPD－PCR最優反應體系(20 μL)為:10×Buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.4 μL，4 種 dNTP(各 2.5 mmol/L)0.8 μL，隨機引物(10 μmol/L)1.4 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，模板 DNA(10 mg/L)1 μL。

圖2 正交組合設計的RAPD－PCR反應體系擴增圖譜

2.3 RAPD－PCR反應的最優退火溫度和循環次數

從圖3中可以看出，在RAPD－PCR反應中所設計的7個溫度梯度中30、34、40、42℃幾乎未擴增出條帶，32、36℃時擴增出的條帶較模糊，在38℃時擴增出的條帶最亮且主帶也最為清晰。

圖3 不同退火溫度下白僵菌RAPD－PCR擴增圖譜

從圖4顯示的循環次數優化結果中可以看到，45次循環時的條帶模糊，產物量較少并且不穩定，35次循環時幾乎未出現條帶，在40次循環時的條帶最為清晰可見并且產物量最多。綜合上述試驗結果確定白僵菌RAPD－PCR反應的最優條件為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s;38℃退火40 s，72℃延伸1 min，40個循環;72℃延伸5 min。

圖4 不同循環次數下白僵菌RAPD－PCR擴增圖譜

3 結論與討論

利用正交組合試驗和單因素梯度試驗對白僵菌基因組DNA、RAPD－PCR反應體系中各組分進行了優化，得出20 μL PCR反應體系中各因素優化組合為，10×Buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.4 μL，4 種dNTP(各 2.5 mmol/L)0.8 μL，隨機引物(10 μmol/L)1.4 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，模板DNA(10 mg/L)1 μL;反應程序的優化條件為，94℃預變性 2 min，94 ℃變性30 s，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環次數40次，72℃延伸5 min。該試驗結果可為研究白僵菌的退化機理和多樣性及種內變異提供一個方便直觀的技術參考。

試驗過程中模板DNA純度和濃度的改變會影響PCR反應中每個產物片段的豐度，因此DNA的提取至關重要，在利用試劑盒抽提DNA的時候以下幾點可以確保提出高質量的模板DNA。①要提前對研缽進行預冷，防止菌絲放入未預冷的研缽中研磨時DNA因高溫而降解，并且在研磨時要迅速不斷地加入液氮冷凍菌絲防止其融化;②在65℃水浴保溫時，時間在15～20 min為最宜，時間太長DNA會因高溫而降解，時間太短蛋白質等雜質消化不完全會污染DNA;③在加入Solution C溶液之后應將離心管上下反復顛倒使其完全混勻在停止顛倒時管內未出現分層即可離心。對于高質量的DNA模板RAPD所需要的DNA標準量在10～100 ng，本試驗所用的DNA模板量均在10 ng左右。

在RAPD技術中不同的引物對Mg2+的濃度要求也不同，其次Mg2+濃度會直接影響TaqDNA聚合酶活性，其濃度過高反應特異性就會降低，濃度過低會大大降低TaqDNA聚合酶活性，從而影響反應的產物量［8－11］。本試驗中所用的緩沖液(10×)不含Mg2+。dNTP作為PCR反應的原料，其濃度過高會導致TaqDNA聚合酶的錯誤摻入，濃度過低又會影響合成效率［12］，筆者采用的dNTP濃度為10 mmol/L，研究中發現隨著dNTP用量的減少，擴增的產物量在逐漸下降，條帶表現為暗淡甚至無條帶。因此，在試驗過程中各個因素之間需要相互的優化組合之后才會取得較好的結果。

對PCR反應的退火溫度和循環次數進行了單因素優化。退火溫度一般參考引物的Tm值，溫度太高或太低都會影響PCR擴增的結果。因此在擴增時，設計了 30、32、34、36、38、40、42 ℃，在這 7 個溫度梯度中30、34、40、42℃幾乎未擴增出條帶，32、36、38℃ 3個退火溫度都有擴增產物，其中38℃時的擴增結果最理想，條帶最清晰。循環次數主要取決于模板DNA和dNTP濃度，在PCR反應過程隨著模板DNA和dNTP濃度的減少，如果循環次數過多或過少產物的量都會減少，因此，在確定模板DNA和dNTP濃度后，最合適的循環次數是PCR反應的關鍵。結果表明，在40個循環時PCR產物量達到最大值，條帶數和清晰度為最優結果，可滿足后續試驗研究。

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