基于響應(yīng)面法優(yōu)化HY15發(fā)酵生產(chǎn)β－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵條件1)

曹冬梅 胡耀輝

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱為CGTase，E.C.2.4.1.19)是一種具有幾種催化功能的多糖類合成酶［1］，能作用于淀粉和其它 α－1，4－葡聚糖合成非還原性的麥芽低聚糖即環(huán)糊精(CD)，因連接葡萄糖基數(shù)(分別為6、7、8 個(gè))不同而分別稱為 α－、β－和 γ－CD［2］。環(huán)糊精具有內(nèi)疏水外親水的筒型結(jié)構(gòu)，因此，它們能與許多疏水化合物或功能基團(tuán)形成包合物［3］，從而改變這些被包結(jié)物質(zhì)的溶解度、揮發(fā)性及化學(xué)反應(yīng)性能等理化性質(zhì)，因而在食品、化妝品、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、輕工、化工、石油、冶金、環(huán)保以及分析化驗(yàn)等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［4－5］。這使得CGTase的生產(chǎn)研究具有重大意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)CGTase和CD的需求量逐年增加，但是因?yàn)榫N產(chǎn)酶量不高，生產(chǎn)成本過(guò)高，限制了它們的擴(kuò)大生產(chǎn)和應(yīng)用［6－7］。本研究從長(zhǎng)白山溫泉泥土中分離篩選到1株以產(chǎn)β－CD為主的高溫菌株HY15。通過(guò)Plackett－Burman 和響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法［8－9］，對(duì)產(chǎn) β－CGTase的高溫菌株HY15培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，研究其發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝條件，為發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)β－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵菌株:高溫菌株HY15，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室在長(zhǎng)白山溫泉泥土中篩選保存。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，鹽溶液10 g/L，pH 值7.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:糊精 10.0 g/L，糖蜜 10.0 g/L，玉米漿 20.0 g/L，酵母浸出粉 10.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，Na2CO30.2 g/L，微量元素 0.5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 值 7.0。

化學(xué)試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320型pH計(jì)，梅特勒—托利多有限公司;TGL－16G臺(tái)式離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司;DL－CJ－IND超凈工作臺(tái)，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京意成東方科技有限公司;UV－1700 PharmaSpec型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津;DSH2－300恒溫培養(yǎng)振蕩箱，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 研究方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

搖瓶發(fā)酵:在250 mL錐形瓶中加入液體培養(yǎng)基50 mL，將預(yù)先培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液按3%加入該培養(yǎng)基中，60℃、以200 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h。發(fā)酵完畢，10 000 r/min離心3 min，上清液即為酶液。

1.3.2 酶活力的測(cè)定

取酶液10 μL用蒸餾水90 μL將之稀釋10倍，取稀釋液10 μL(對(duì)照不加樣品)加入0.2 mol/L甘氨酸－NaOH－NaCl緩沖液(pH 值 8.55)0.2 mL，放入40℃水浴中加入0.2%馬鈴薯淀粉溶液(空白不加馬鈴薯淀粉溶液)0.2 mL后準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min后放于冰水浴中，加入0.5 mol/L醋酸0.5 mL終止反應(yīng)，然后加入0.005%碘液3 mL顯色，同時(shí)以蒸餾水為空白，不加酶液為對(duì)照，在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD)，以光密度下降10%的酶量定為1個(gè)單位［10］。按以下公式計(jì)算:

式中:a為對(duì)照組的吸光度;b為樣品的吸光度。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì):選用N=12的 PB設(shè)計(jì)表，對(duì)影響高溫菌株HY15發(fā)酵生產(chǎn)β－CGTase的10個(gè)因素進(jìn)行考察，其中低水平“－1”值采用培養(yǎng)基成分的原始濃度，高水平“+1”值采用低水平的倍數(shù)［11］，Plackett－Burman 試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 Plackett－Burman試驗(yàn)因素水平及編碼

Box－Behnken和響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)PB試驗(yàn)確定的因素和最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，按照Box－Behnke設(shè)計(jì)原理［12］安排響應(yīng)面分析試驗(yàn)獲得重要因素的最佳配方水平。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果，來(lái)擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即:

式中:Y為響應(yīng)值;b為回歸系數(shù);x為自變量值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett－Burman 試驗(yàn)結(jié)果

以β－CGTase活性為考察指標(biāo)，15次試驗(yàn)的結(jié)果依次為:1 086.76、1 077.63、1 066.21、1 127.85、1 132.42、1121.00、1125.57、1118.95、1114.16、1 111.87、1073.06、1086.76、1125.57、1120.46、1 118.72 U·mL－1。由表 2 可見(jiàn)，玉米漿、K2HPO4對(duì) β－CGTase產(chǎn)率的影響極顯著(P＜0.01)，玉米淀粉、糖蜜、pH、MgSO4、酵母浸粉對(duì) β－CGTase 產(chǎn)率影響顯著(P＜0.05)，其他因素 NaCl、微量元素、Na2CO3對(duì)β－CGTase產(chǎn)率影響不顯著，建立的一階模型為:

式中:X1～X10分別為糊精、糖蜜、玉米漿、酵母浸粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3、金屬溶液、NaCl、pH。P=0.013 8＜0.05，說(shuō)明此模型顯著，其中 98.36%的數(shù)據(jù)可以用此模型解釋(R2=0.983 6)。

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.2 Box－Behnken試驗(yàn)及響應(yīng)面分析結(jié)果

以Plackett－Burman試驗(yàn)結(jié)果得出的關(guān)鍵因素:糖蜜+玉米淀粉(x1)，K2HPO4(x2)，MgSO4(x3)，玉米漿+酵母(x4)，pH值(x5)5個(gè)因素作為中心組合試驗(yàn)因素，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行5因素5水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。中心組合試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表3，以β－CGTase活性為考察指標(biāo)，32次中心組合試驗(yàn)的結(jié)果依次為:1 239.33、1 190.00、1 220.67、1177.00、1343.33、1288.33、1320.67、1 298.00、1 267.00、1 171.67、1 259.00、1 191.33、1 240.33、1 210.67、1 238.33、1 178.33、1 349.00、1 287.33、1238.67、1342.00、1219.67、1203.00、1 306.33、1 194.33、1 266.67、1 304.67、1 402.67、1 390.33、1 403.33、1 399.67、1 395.33、1 396.33 U/mL。通過(guò)32組試驗(yàn)，尋找出5因素的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)，經(jīng)過(guò)SAS 8.2軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到二次響應(yīng)面回歸方程為:

式中:Y為 β－CGTase 產(chǎn)率;x1、x2、x3、x4、x5分別為糖蜜+玉米淀粉、K2HPO4、MgSO4、玉米漿+酵母、pH 的編碼值。回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)判定，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析結(jié)果見(jiàn)表4～表6。

表3 中心組合試驗(yàn)因素水平編碼

由表4可知，建立的回歸模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著。模型可信度分析表明，回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.945 5，變異系數(shù)2.545 8%，說(shuō)明擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。因此，可以用此回歸方程模擬高溫菌株HY15發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組成。

表4 回歸方程的方差分析結(jié)果

由表5可知，二次回歸模型的一次項(xiàng)x3、x4、x5以及二次項(xiàng)和交互項(xiàng)x3x4對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P＜0.01)。x1x3對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(P＜0.05)，x1、x2、x2x1、x5x4、x4x1、x4x2、x5x1、x5x2、x5x3、x3x2對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著(P＞0.05)。各試驗(yàn)因素對(duì)高溫菌株HY15產(chǎn)β－CGTase的影響由大到小依次為:pH、MgSO4、玉米漿+酵母、K2HPO4、糖蜜+玉米淀粉。

方程局部最優(yōu)點(diǎn)即是最佳的試驗(yàn)水平，利用求極值的方法求解最優(yōu)水平。對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，并當(dāng)?shù)竭_(dá)局部最優(yōu)點(diǎn)時(shí)，導(dǎo)數(shù)為零。求得:糖蜜+玉米淀粉 22.45 g/L，K2HPO40.97 g/L，MgSO40.18 g/L，玉米漿+酵母21.82 g/L，pH 值 6.98，在此條件下酶活的預(yù)測(cè)值為1 409.70 U/mL。

表5 中心組合試驗(yàn)方差分析結(jié)果

Y=f(X3，X4)的響應(yīng)面及等高線如圖1所示。由圖1A－圖1B可見(jiàn)，其他變量取零水平，該變量對(duì)指標(biāo)的影響情況，可以看出在所選的因素水平范圍內(nèi)存在極值。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的有效性，在響應(yīng)面分析得到的菌種發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝參數(shù)條件下進(jìn)行菌株HY15產(chǎn)β－CGTase試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，測(cè)得菌株發(fā)酵產(chǎn)β－CGTase實(shí)際酶活力的平均值為1 401.81 U/mL。與理論預(yù)測(cè)值 1 409.70 U/mL 接近，相對(duì)誤差為0.56%，說(shuō)明該回歸模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性比較高。

3 結(jié)束語(yǔ)

利用Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察影響高溫菌株HY15發(fā)酵生產(chǎn)β－CGTase的10個(gè)相關(guān)因素，從中篩選出糖蜜+玉米淀粉、K2HPO4、MgSO4、玉米漿+酵母、pH值5個(gè)對(duì)菌種發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因素(P＜0.05)。然后通過(guò) Box－Behnken設(shè)計(jì)法得到回歸方程，通過(guò)求函數(shù)最大值確定這5種成分的最佳水平混合為:糖蜜+玉米淀粉22.45 g/L、K2HPO40.97 g/L、MgSO40.18 g/L、玉米漿+酵母21.82 g/L、pH值6.98。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件下，β－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)到1 409.70 U/mL。驗(yàn)證值1 401.81 U/mL，二者吻合較好。

圖1 MgSO4和玉米漿+酵母對(duì)酶活的響應(yīng)面圖(A)和等值線圖(B)

［1］Tachibana Y，Kuramura A，Shirasaka N，et al.Purification and characterization of an extremely thermostable cyclomaltodextrin glucanotransferase from a newly isolated hyperthermophilic archaeon，aThermococcussp.［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(5):1991－1997.

［2］Abelyan V A，Balayan A M，Manukean L S，et al.Characteristics of cyclodextrin production using cyclodextrin glucanotransferases from various groups of microorganisms［J］.Applied Biochemistry and Microbiology，2002，38(6):527－535.

［3］Bender H.Production characterization and application of cyclodextrin［J］.Adv Biotechnol Processes，1986，6:31－37.

［4］田輝，楊國(guó)武，徐頤玲，等.環(huán)狀糊精與環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶［J］.工業(yè)微生物，1995，25(2):33－38.

［5］Rao P，Suresh C，Narasimha Rao D，et al.Digestion of residual βcyclodextrin in treated egg using glucoamylase from a mutant strain ofAspergillus niger［J］.Food Chemistry，1999，65(8):297－301.

［6］唐上華，馮吉吉，黃蕊新，等.嗜堿性芽孢桿菌N－227β－環(huán)狀糊精葡基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)［J］.工業(yè)微生物，1990，20(1):1－5.

［7］唐上華，王磊，周新宇，等.嗜堿性芽孢桿菌N－227環(huán)狀糊精葡基轉(zhuǎn)移酶基因在枯草桿菌中的整合表達(dá)［J］.工業(yè)微生物，1995，25(1):1－4.

［8］Ramkrishna S，Swaminathan T.Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the effects of inoculum age and size on surfactin production［J］.Biochemical Engineering Journal，2004，21(2):141－148.

［9］Stowe R A，Mayer R P.Efficient screening of process variables［J］.Industrial and Engineering Chemistry，1966，58(2):36－40.

［10］張心平，張善鎬.環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌的初步鑒定及其產(chǎn)酶條件［J］.南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1993，28(2):63－68.

［11］李春英，李曉娟，楊磊，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化甘草酸和甘草黃酮聯(lián)合提取工藝［J］.黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26(3):390－395.

［12］Pan C M，F(xiàn)an Y T，Xing Y，et al.Statistical optimization of process parameters on biohydrogen production from glucose byClostridiumsp.Fanp2［J］.Bioresource Technology，2008，99(8):3146－3154.