鉛鋅礦區(qū)土壤細(xì)菌群落多樣性分析1)

任廣明 張 琦 曲娟娟 閆立龍 孫興濱

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150030) (哈爾濱工程大學(xué)) (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué))

鉛鋅通常是礦區(qū)土壤中含量較高的有毒重金屬，它們?cè)谕寥乐锌偸遣粩嗟匕l(fā)生時(shí)空遷移和價(jià)態(tài)、形態(tài)轉(zhuǎn)化［1］。這不僅影響了土壤微生物的種類和數(shù)量、土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化等生化轉(zhuǎn)化過(guò)程，同時(shí)影響著植物的生長(zhǎng)質(zhì)量、產(chǎn)量等［2］。鉛鋅等大多數(shù)重金屬具有可遷移性差，不能降解等特點(diǎn)，會(huì)在生態(tài)系統(tǒng)中不斷積累，毒性不斷增強(qiáng)，從而導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的退化［3］。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)，它們不僅調(diào)節(jié)著土壤動(dòng)植物殘?bào)w和土壤有機(jī)物質(zhì)及其它有害化合物的分解、生物化學(xué)循環(huán)和土壤結(jié)構(gòu)的形成等過(guò)程，且對(duì)外界干擾比較靈敏，能夠較早地預(yù)測(cè)土壤環(huán)境質(zhì)量的變化過(guò)程，被認(rèn)為是最有潛力的敏感性生物指標(biāo)之一［4－5］。土壤中鉛鋅等重金屬的存在無(wú)疑會(huì)對(duì)土壤微生物的群落構(gòu)成產(chǎn)生一定的影響，甚至?xí)饍?yōu)勢(shì)種群的改變，同樣會(huì)引起微生物多樣性的降低。因此，土壤重金屬污染與土壤微生物群落之間的關(guān)系是國(guó)內(nèi)外環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)［6］。本試驗(yàn)對(duì)黑龍江省某鉛鋅礦區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及土壤酶活性進(jìn)行了研究，旨在探討該礦區(qū)鉛鋅污染程度與土壤酶活性、土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性之間的相互關(guān)系，為同類污染礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

樣品采集:以鉛鋅礦區(qū)采礦口為基點(diǎn)，在距離礦口 100、200、400、600、800、1 000 m 處按對(duì)角線取樣法多點(diǎn)混合方式取樣，取樣深度20 cm。非礦區(qū)土壤樣品采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院試驗(yàn)站。將采取土樣裝入無(wú)菌封口塑料袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分新鮮土樣置于冰箱內(nèi)保存用于土壤細(xì)菌總DNA的提取;另一部分土樣置于室內(nèi)自然風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性測(cè)定。

土壤重金屬含量、理化性質(zhì)及酶活性測(cè)定:土壤鉛鋅全量采用王水—高氯酸強(qiáng)酸消解法消化［7］，原子吸收分光光度法測(cè)定;土壤理化性質(zhì)按常規(guī)方法測(cè)定［8］;過(guò)氧化氫酶、脲酶、磷酸酶酶活性按關(guān)松蔭方法測(cè)定［9］。

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析:土壤總DNA的提取采用改良的Zhou等提出的方法［10］。純化采用天根通用型DNA純化回收試劑盒。應(yīng)用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)域通用引物對(duì)提取的礦區(qū)土壤總DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增［10］。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用Bio－Rad公司DcodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。變性梯度為30% ～60%，使用的電泳緩沖液為1×TAE，上樣量為20 μL DNA+10 μL 6×溴酚藍(lán)二甲苯氰溶液，電泳電壓150 V，60℃，300～350 min。凝膠染色采用銀染法。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0、NTSYS等統(tǒng)計(jì)軟件分析。將凝膠成像上出現(xiàn)的DNA片段計(jì)為1，不出現(xiàn)的計(jì)為0，統(tǒng)計(jì)后輸入電腦，用NTSYS聚類分析軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析，同時(shí)運(yùn)用軟件構(gòu)建7個(gè)土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性樹狀圖。DGGE條帶的數(shù)目可代表微生物群落的豐富度(S)。基于DGGE條帶的遷移率和條帶的強(qiáng)度分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)用Shannon－Weaver指數(shù)H來(lái)表示。Shannon－Weaver指數(shù):H=－∑(ni/N)log(ni/N)。式中:ni為峰面積，N為所有峰總面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤重金屬鉛鋅全量及酶活

2.1.1 土壤重金屬鉛鋅全量

供試土壤重金屬鉛鋅全量分析結(jié)果如表1所示。從礦口到距離礦口1 000 m處礦區(qū)土壤的重金屬鉛鋅全量逐漸降低，重金屬鉛全量分別是非礦區(qū)土壤(7 號(hào))的 32.98、18.93、15.49、9.48、9.01、6.07倍;重金屬鋅全量分別高出非礦區(qū)土壤10.21、10.09、9.63、8.48、7.47、5.82 倍，表明礦區(qū)土壤均受到不同程度的重金屬?gòu)?fù)合污染。數(shù)據(jù)經(jīng)LSR測(cè)驗(yàn)表明，從礦口到外圍各土壤中鉛鋅全量與非礦區(qū)土壤中鉛鋅全量均存在顯著性差異(P＜0.05)。土壤C/N比的變化與所在環(huán)境的水熱條件和成土作用過(guò)程密切相關(guān)［11］。從表1可以看出，供試土壤C/N比較低，這可能是由于礦區(qū)特定的地理環(huán)境所致。pH及陽(yáng)離子交換量一定程度上反應(yīng)土壤膠體結(jié)構(gòu)、緩沖能力、土壤肥力等，可見供試的礦區(qū)土壤緩沖能力、肥力較低，其pH和陽(yáng)離子交換量與非礦區(qū)土壤均存在顯著性差異(P＜0.05)。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)

2.1.2 土壤酶活性測(cè)定

由表2可見，從礦口到外圍土壤過(guò)氧化氫酶、磷酸酶、脲酶活性與非礦區(qū)土壤酶活性均存在極顯著性差異(P＜0.01)。3種土壤酶活性的變異系數(shù)分別為 37.60%、26.75%、47.22%，其中脲酶活性變異系數(shù)最大，說(shuō)明礦區(qū)土壤脲酶活性的變化程度最大。從表3可知，土壤過(guò)氧化氫酶活性與全鉛、全鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05);土壤磷酸酶活性與全鉛質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與全鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01);土壤中的脲酶活性與全鉛質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與全鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。土壤中的酶對(duì)土壤重金屬污染均較為敏感，礦區(qū)土壤中的重金屬污染均抑制了過(guò)氧化氫酶、磷酸酶、脲酶活性。

表2 重金屬污染下土壤酶活性變化 μg·g－1

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

2.2.1 PCR－DGGE 指紋圖譜

用改良的化學(xué)裂解法提取土壤總DNA，DNA片段大小為23.1 kb。用天根土壤DNA純化回收試劑盒純化土壤總DNA，純化后進(jìn)行土壤總DNA的PCR擴(kuò)增，得到大小在230 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖1。

圖1 土壤細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

表3 土壤酶活性與鉛鋅全量之間的相關(guān)系數(shù)

DGGE指紋圖譜中條帶越豐富表明土壤微生物群落種類相對(duì)越豐富，條帶顏色越深在一定程度上可以反映該種微生物所占比例越大，數(shù)量越多［12］。圖2中，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)圖譜條帶相對(duì)較少，說(shuō)明重金屬污染嚴(yán)重的土壤中鉛鋅對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生了明顯的毒害作用，使得少部分細(xì)菌不能進(jìn)行正常生長(zhǎng)，致使細(xì)菌種群數(shù)量減少甚至衰亡，發(fā)生菌群的缺失，直接導(dǎo)致細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;從圖2正三角標(biāo)注的條帶可知，重金屬污染土壤中存在具有較強(qiáng)耐受重金屬能力的共有細(xì)菌，并作為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌穩(wěn)定存在。圖譜中條帶的明暗變化表明這些細(xì)菌雖然穩(wěn)定存在，但仍受到重金屬鉛、鋅不同程度上的影響。4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)圖譜細(xì)菌種群及數(shù)量有明顯增加(倒三角標(biāo)注)，這是由于土壤中的細(xì)菌長(zhǎng)期在重金屬的選擇作用下，不斷增強(qiáng)自己的耐性、抗性，具有了高度的選擇性，通過(guò)各種氧化還原、酶化等代謝活動(dòng)來(lái)適應(yīng)重金屬污染的環(huán)境;7號(hào)圖譜表現(xiàn)出較豐富的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。

圖2 土壤細(xì)菌16S rDNA的PCR－DGGE指紋圖譜

細(xì)菌群落相似性聚類分析主要根據(jù)DGGE圖譜中每個(gè)樣品中不同條帶的強(qiáng)度和遷移率對(duì)每個(gè)樣品的條帶圖譜進(jìn)行細(xì)菌群落相似性聚類分析。通過(guò)NTSYS聚類分析軟件將供試的7個(gè)土壤樣品的指紋圖譜進(jìn)行UPGMA法聚類分析。從圖3可以看出:供試的7個(gè)土壤樣品在相似距離為10時(shí)分為4簇，第1簇是4號(hào)、5號(hào)、6號(hào);2號(hào)、3號(hào)歸為一簇;1號(hào)，7號(hào)各成一簇。

圖3 DGGE聚類分析圖譜

2.2.2 土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性指數(shù)

DGGE條帶的數(shù)目可代表微生物群落的豐富度(S)。從表4可知，不同土壤細(xì)菌群落的豐富度存在差異，其中非礦區(qū)土壤(7號(hào))圖譜中條帶數(shù)最多(19條)，其細(xì)菌群落豐富度最大，礦區(qū)1號(hào)土壤的條帶數(shù)最少(7條)，其微生物群落豐富度最小。與非礦區(qū)土壤相比礦區(qū)土壤的微生物群落豐富度分別為非礦區(qū)土壤的 26.92%、30.77%、34.62%、38.46%、50%、69.23%，土壤細(xì)菌群落的豐富度簡(jiǎn)明地表達(dá)了土壤細(xì)菌群落多樣性的一個(gè)方面，但它未能反映群落功能多樣性相對(duì)多度的信息［13］。

表4 供試土壤微生物群落豐富度和多樣性指數(shù)

Shannon－Weaver(H)多樣性指數(shù)是表征群落中物種數(shù)目多少、衡量群落結(jié)構(gòu)和重要性的基礎(chǔ)。物種多樣性指數(shù)越大說(shuō)明各個(gè)種個(gè)體數(shù)量分布越均勻、種類越多［14］。從表4可知，土壤(1～6號(hào))的細(xì)菌群落多樣性Shannon－Weaver指數(shù)明顯低于非礦區(qū)土壤(7號(hào))，最大為1.15，最小為0.84。統(tǒng)計(jì)分析顯示，除1號(hào)和2號(hào)土壤細(xì)菌群落 Shannon－Weaver指數(shù)不存在差異性外，其它供試土壤細(xì)菌群落Shannon－Weaver指數(shù)的差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。可見，土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)受到了重金屬不同程度上的影響，導(dǎo)致細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量出現(xiàn)了相應(yīng)的降低。

3 結(jié)論與討論

PCR－DGGE是1993年由Myuzer首先應(yīng)用到微生物分子生態(tài)學(xué)的一門分子生物技術(shù)［15－16］，是研究微生物群落多樣性、分析環(huán)境中微生物群落動(dòng)態(tài)變化情況、了解生境對(duì)微生物群落多樣性及菌群活性影響的一種分子技術(shù)［5，17］。運(yùn)用DGGE方法可以揭示環(huán)境污染條件下微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性［18］。kozdrój等［19］、趙祥偉等［20］、張洪勛等［21］已成功將PCR－DGGE方法應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定土壤理化性質(zhì)及酶活發(fā)現(xiàn)，礦區(qū)土壤重金屬鉛鋅污染嚴(yán)重，鉛鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)與土壤酶活均成顯著負(fù)相關(guān)，這說(shuō)明土壤中的重金屬抑制了細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步影響土壤酶活性變化，土壤酶活性較非礦區(qū)土壤偏低;試驗(yàn)建立了適用于PCR－DGGE技術(shù)的重金屬污染土壤基因組DNA的快速提取方法，獲得了純度較高的DNA模板，保證了PCR擴(kuò)增反應(yīng)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，進(jìn)而使得細(xì)菌指紋圖譜及聚類分析真實(shí)有效。DGGE聚類分析結(jié)果顯示，距離礦口100、200、400 m土壤樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較強(qiáng)，相似距離相近，距離礦口600、800、1 000 m歸為一簇表觀上條帶有所增多，這是由于較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)鉛、鋅對(duì)礦區(qū)土壤細(xì)菌影響較小，重金屬污染礦區(qū)土壤中重金屬鉛、鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高土壤中細(xì)菌群落及數(shù)量越少，這與 Hiroki［22］、滕應(yīng)等［11］、Bisessar等［23］的研究結(jié)果相一致。重金屬污染土壤真菌、放線菌試驗(yàn)正在進(jìn)行中。從上述研究結(jié)果可以看出，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性是指示礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量變化靈敏、有效的生物學(xué)指標(biāo)之一，并為進(jìn)一步研究重金屬污染條件下土壤的質(zhì)量與功能提供了基礎(chǔ)。

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