基于CdSe/ZnS核殼型量子點的高靈敏、快速細菌計數新方法的研究*

傅 昕，張 何，胡家義，石 敏

(湖南工程學院化學化工學院，湖南湘潭411104)

細菌是單細胞微生物的主要類群之一，是所有生物中數量最多的一類。其中一些細菌屬于病原體，能引起感染性疾病，比如霍亂、梅毒、炭疽病、尿道炎、膀胱炎和痢疾等。細菌(尤其是病原菌)的檢測涉及到食品安全檢驗、疾病診斷以及環境監測等領域，與人類健康和社會安定息息相關。傳統的細菌檢測方法(如比濁法和平板計數方法)靈敏度低、費時耗力，不能滿足當前食品安全快速檢測的要求。近年來，報道了一些的細菌計數的新方法，包括酶聯免疫法 (ELISA)[1]、PCR 法[2]和流式細胞計數法[3]，這些新方法雖然縮短了檢測時間、增強了檢測信號，但是檢測儀器昂貴、并且檢測前需預先富集[4]。目前，熒光檢測方法有效地克服了這些缺點，更有利于快速、簡單、有效的對原始樣品直接進行細菌計數[5－8]。然而，現有的熒光檢測法一般以有機熒光染料作為熒光標記物，因此還是存在許多不足之處。

與傳統有機熒光染料相比，量子點具有激發光譜寬、發射光譜對稱、半峰寬窄(20 nm～30 nm)，發射波長可調(400 nm到2 μm不等)等特點。另外量子點為多電子體系，熒光效率高于單個分子，且光化學穩定性強，不易分解，不易漂白，在某些情況下其發光時間可達染料分子的100倍。早在1998年Alivisatos[9]等及Nie等[10]首次報道將QDs應用于細胞熒光標記、成像等方面的研究，隨著對QDs研究的不斷深入，其應用范圍由最初的生物學擴展到醫藥學、食品、環境保護等多個領域[11－14]。裸量子點顆粒(如 CdSe)易受雜質和晶格缺陷的影響，其量子產率很低，化學家們經過多年努力，通過在核表面覆蓋另一層晶體結構相似、帶隙更大的半導體材料(如ZnS)，使量子點表面無輻射重組位置被鈍化、減少激發缺陷，且能有效限制對核的激發，消除非輻射弛豫，使熒光量子產率和光熱穩定性都得到了大大的提高[15－18]。因此，核殼型量子點是一種更理想的熒光標記物。目前為止，雖然已經有一些用量子點標記抗原和酶來快速、特異性的檢測病原體細菌的報道，但是用核殼型量子點來進行細菌計數的研究還非常少。

本文以乙酰丙酮鎘和硬脂酸鋅作為前驅體合成了單分散性的、熒光效率高的核殼型量子點，并充分利用核殼型量子點優良的光學性能，以EDC/NHS作為交聯劑，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(S.aureus)作為檢測目標，建立了一種高靈敏的、簡單快速的細菌計數新方法。在優化的實驗條件下，體系的相對熒光強度隨細菌數量的增加而增大，線性范圍為102CFU/mL～106CFU/mL(跨越4個數量級)，檢測限為102CFU/mL。此外，該方法操作簡單，不需要昂貴的試劑和儀器，檢測時間短(1 h～2 h)。我們還對5種實際樣品進行了細菌數量測定，檢測結果與傳統的平板計數方法基本一致，相對標準偏差在3.6% ～8.1%之間。由此可見，基于CdSe/ZnS核殼量子點的熒光標記技術，為細菌的快速、靈敏的定量檢測提供了新的契機，顯示出廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器

F－2500型熒光分光光度計(日本日立公司);JEOL JEM－1230型透射電鏡TEM(Transmission E-lectron Microscopy;日本電子株式會社);PHS－25型酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司);SHZ－82水浴恒溫振蕩器(金壇市文華科教實驗儀器廠);Zeiss熒光倒置顯微鏡(Zeiss Axio Observer Z1);QYC－200全溫培養搖床(上海福瑪公司);TD4A型臺式離心機(長沙英泰儀器有限公司)。

1.2 試劑

三辛基氧化膦(TOPO，90%)，三辛基膦(TOP，98%)，十六烷基胺(HDA，90%)，1，2－十六烷二醇(90%)，乙酰丙酮鎘(＞99.9%)，硬脂酸鋅(95%)，3－巰基丙酸(MPA，＞99.0%)，1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC，＞98%)，N－羥基琥珀酰亞胺(NHS，＞98%)，Se粉(＞99.5%)，硫粉(99.5%)均購買于 Sigma-Aldrich Chemical Co。

1.3 實驗方法

1.3.1 巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS核殼型量子點的合成

CdSe核的制備 參照并改進文獻[19]方法，在N2保護下，將11.84 mg硒粉溶入2.5 mL TOP 中，得到Se的前驅體溶液(TOPSe);將0.310 6 g乙酰丙酮鎘和0.568 g 1，2－十六烷二醇溶解于3 mL TOP中，制得Cd前驅體溶液;然后往三頸燒瓶中依次加入3.125 g TOPO、2.875 g HDA 以及 1.7 mL TOP，緩慢加熱到360℃，將Cd、Se前驅體溶液快速加入，并調節溫度至300℃，直到獲得所需波長的量子點。

CdSe/ZnS核殼量子點的制備[20]氮氣保護下，0.316 g硬脂酸鋅溶于2.5 mL甲苯中，得 Zn前驅體溶液;16 mg的S粉溶于2.5 mL TOP中，得S前驅體溶液;向三頸燒瓶中加入20 mg CdSe、4 mL正庚烷、2.5 g TOPO和1.5 g HDA。混合溶液加熱至190℃，然后把Zn、S的前驅體溶液緩慢加入反應器中，保持溫度在190℃ ～200℃反應1 h，即得CdSe/ZnS核殼量子點。

最后將20 mg CdSe/ZnS核殼型量子點溶于1.0 mL 氯仿中，加入 100 μL 0.1 mol/L 的巰基丙酸，攪拌過夜。洗滌干燥后即得水溶性的巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS核殼型量子點(MPA-CdSe/ZnS core/shell QDs)[21]。

1.3.2 細菌培養和計數

金黃色葡萄球菌(S.aureus)菌株是由中南大學生物實驗室提供。把金黃色葡萄球菌用LB(Luria Bertani)培養基，在37℃中恒溫培養48 h。培養出的細菌數量通過平板計數法可以獲得。細菌通過無菌的PBS(pH 7.4)溶液離心洗滌，最后在PBS溶液中保存。

1.3.3 MPA-CdSe/ZnS 與細菌的結合過程

MPA-CdSe/ZnS與金黃色葡萄球菌結合用EDC和NHS作為交聯劑。為了測試量子點與細菌結合的最佳條件，我們先將100 μL 1 mg/mL的EDC加入200 μL不同濃度的MPA-CdSe/ZnS量子點中，攪拌15 min。再加入100 μL 0.15 mg/mL 的 NHS，反應20 min。EDC與量子點表面的羧基發生反應，形成有活性的中間體，NHS能在水溶液中穩定此中間體[22－23]。最后與細菌在37 ℃孵育10 min ～70 min。混合溶液通過0.22 μm超濾膜純化，除去過量的量子點。同時我們將不加EDC/NHS的反應體系做為對照實驗。

2 結果與討論

2.1 CdSe/ZnS量子點的性能表征

2.1.1 CdSe/ZnS QDs熒光光譜圖

量子點作為一種半導體納米晶體，粒徑不同時會產生不同顏色的熒光。取適量的產物溶液，用F－2500型熒光分光光度計對其進行熒光發射光譜的測定。圖1(a)為不同反應時間(30 s，30 min和2 h)取樣所得到的量子點的熒光發射光譜圖，從圖中可以看出，所制備的量子點峰型窄而對稱，半峰寬均在30 nm左右，沒有拖尾現象，說明其尺寸分布較窄。根據納米粒子的尺寸D與其熒光峰 λe之間的關系[24]:。以此計算以上 3個反應時間制得的樣品(發射波長分別為520 nm、570 nm、615 nm)的粒徑分別為 3.0 nm、3.3 nm、4.9 nm。插圖為反應2 h后所得的核殼型量子點的透射電鏡圖。由圖可以看到，量子點大小為5 nm左右，形狀呈類球型，并且分布均勻，很少團聚，具有良好的單分散性和均一性。該透射電鏡(TEM)表征與粒徑計算結果互為佐證。

圖1

2.1.2 CdSe/ZnS QDs熒光穩定性考察

我們還將CdSe/ZnS核殼型量子點與異硫氰酸熒光素(FITC)和德克薩斯紅(Texas Red)兩種熒光染料的抗光漂白性能進行了比較。我們采用F－2500型熒光分光光度計進行熒光強度的測定，連續掃描60 min，并實時觀察其熒光強度的變化。結果表明CdSe/ZnS抗光漂白性大大優于熒光染料。FITC和Texas Red的熒光強度在15 min時已經減低了15%，在30 min時已經基本消失，而CdSe/ZnS量子點的熒光強度在60 min時基本維持不變(圖1(b))。此外，進一步考察了放置時間對于其穩定性的影響，實驗中發現，室溫下放置5個月以后，幾乎觀察不到沉降等現象，光譜性能依然良好，表明該量子點具有非常優良的穩定性，為進一步的應用研究提供了保證。上述性能表征結果表明，所制備的CdSe/ZnS量子點具有良好的光譜性能，并且大小均一，單分散性好，為接下來的應用研究奠定了基礎。

2.2 MPA-CdSe/ZnS量子點檢測細菌的原理

由于巰基丙酸修飾的量子點表面有許多羧基基團，EDC可以與量子點表面的羧基發生反應，形成有活性的中間體，NHS在水溶液中穩定此中間體，最后中間體與細菌表面蛋白上的氨基結合(圖2)。所以細菌的數量越多，與其結合的量子點也越多，體系熒光強度也就越大，從而可以根據熒光強度的變化達到定量檢測細菌的目的。

圖2 CdSe/ZnS量子點檢測細菌的原理

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 量子點和細菌孵育時間的選擇

為了確定最佳的孵育時間，我們做了一系列條件實驗。首先，將100 μL 1 mg/mL 的 EDC、200 μL 5.0 mg/mL MPA-CdSe/ZnS 量子點和100 μL 0.15 mg/mL的NHS反應20 min。然后加入一定數量的細菌，在37℃中分別孵育10 min～70 min。圖3(a)顯示了孵育時間對體系熒光強度的影響。從圖中看出，體系的熒光強度在0～50 min內隨時間的增長而升高，超過50 min后熒光強度基本保持穩定，說明50 min時反應已經基本完成。故本實驗選擇孵育時間為50 min。

圖3 體系熒光強度所受影響

2.3.2 MPA-CdSe/ZnS QDs稀釋度的選擇

我們還考察了量子點稀釋度對于體系熒光強度的影響(圖3(b))，量子點的原始濃度為5.0 mg/mL。結果表明，量子點在1∶2～1∶32稀釋度范圍內時，體系的熒光強度隨著量子點的稀釋度的減小(即量子點濃度的增大)而增大，在稀釋度為1∶2時，熒光強度達到最大值。因此，在以下試驗中，選用1∶2的量子點稀釋度，即量子點濃度為2.5 mg/mL。

2.4 MPA-CdSe/ZnS與細菌結合后的熒光顯微鏡成像

為了驗證量子點與細菌完全結合，我們借助熒光顯微鏡成功的進行成像探測研究(圖4)。由圖可知，量子點EDC/NHS的交聯作用下，已經成功的與S.aureus結合，細菌表面表現出較強的熒光(圖4(b))，進一步證實了實驗的原理。同樣，作為平行對照實驗，對于沒有EDC/NHS交聯劑的體系我們也進行了熒光顯微鏡成像(圖4(c))，細菌表面觀察不到熒光信號的表達。由此我們可以得出，該方法制備的核殼型量子點熒光納米顆粒具有良好的特異性，為接下來的定量檢測奠定了堅實的基礎。

圖4 EDC/NHS存在下，量子點與S.aureus結合后的明視場成像(A)和熒光成像(B);(C)無EDC/NHS時，量子點與S.aureus結合后的熒光成像

2.5 檢測范圍和檢測限的考察

我們進一步考察了基于MPA-CdSe/ZnS核殼量子點對細菌定量測定的線性范圍和最低檢測濃度，在最優檢測條件下即在37℃下，S.aureus與2.5 mg/mL CdSe/ZnS QDs反應50 min后進行測定，結果如圖5所示。從圖5可以看出，金黃色葡萄球菌總數量在102CFU/mL～108CFU/mL范圍內時，體系的相對熒光強度隨細菌數量的增加而增大。且當金黃色葡萄球菌總數量在102CFU/mL～106CFU/mL范圍時，細菌總數與體系熒光強度呈現出良好的線性關系(圖5插圖)，線性回歸方程為 Y=427.586X－677.022，線性相關系數 R為0.99649。由此可以看出，該方法的線性范圍寬(跨越4個數量級)，檢測限低(102CFU/mL)，優于基于ATP的生物熒光檢測方法(檢測限為103CFU/mL)和基于有機染料SYBR GreenⅡ的熒光檢測方法(檢測限為105CFU/mL)。并且該方法重現性好，總反應時間短(從加樣到獲得最后的信號少于2 h)。綜上所述，基于MPA-CdSe/ZnS核殼量子點對細菌定量檢測的方法可用于一定數量范圍內細菌的定量研究。

圖5 S.aureus數量與體系熒光強度的標準曲線圖和線性關系圖(插圖)

2.6 實際樣品檢測

為了進一步證實該方法的可行性和實用性，我們把該方法用于實際樣品的細菌計數中。表1即為5個實際樣品的測定結果。所有樣品在測試前都需經過離心過濾純化。從表1可以得出，5個實際樣品的測試結果和常用的平板計數法基本一致，相對標準偏差(RSD%)都在3.6～8.1之間，是非常令人滿意的，有望進一步實際應用。

表1 實際樣品的檢測結果

3 結論

本工作合成了具有優良光學性能、分散性好、粒徑均一的CdSe/ZnS核殼量子點的CdSe/ZnS核殼型量子點。在EDC/NHS交聯作用下，以量子點作為熒光探針，金黃色葡萄球菌(S.aureus)作為目標細菌，利用量子點表面羧基與細菌表面氨基之間的作用，建立了一種高靈敏的、簡單快速的細菌計數的新方法。在最優化的實驗條件下，體系的相對熒光強度隨細菌數量的增加而增大，該方法的線性范圍為102CFU/mL～106CFU/mL，檢測限為102CFU/mL。該方法有效克服了有機熒光染料光穩定性差等缺陷，具有簡單直接、條件溫和、檢測時間短(1 h～2 h)、靈敏度高和線性范圍寬(跨越4個數量級)等優點。此外，我們還對5種實際樣品進行了細菌計數，檢測結果與平板計數方法基本一致，相對標準偏差在3.6% ～8.1%之間，并且有好的重現性。

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