共固定化細胞在生物飼料發酵生產中的應用

魏甲乾 楊宗賢 陳 娟 魏亞琴 王治業

（1.甘肅省科學院生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅帝旺生物科技有限責任公司，甘肅 蘭州 730060)

20世紀80年代以來，隨著我國養殖業連續20多年以年平均9%以上的高速度增長，畜牧主產區的飼料資源短缺問題也將越來越嚴重。而飼料生產成本居高不下，原料漲價使飼料生產企業處于虧損的邊緣，養殖業經濟效益難以保障，影響到了農民的生計問題。針對上述問題只有對生產環節進行技術創新，大力發展微生物飼料，才能促進畜牧產業的良性發展。

固定化細胞技術作為20世紀70年代興起的一種新型生物技術，由于具有諸多優勢而廣泛應用于發酵工業、食品工業、環境保護、生物制藥、化工及能源等領域，發揮著巨大作用。本研究利用聚乙烯醇復合凝膠對產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、產脂酵母和啤酒酵母等混合細胞進行共固定化，通過對混合細胞的共固定化條件和最適增殖條件的研究，為其在生物飼料發酵生產中的應用積累實踐經驗，取得較好效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、啤酒酵母、產脂酵母、綠色木霉、米曲霉等，以上菌種均由中國工業微生物菌種保藏中心甘肅分中心提供；聚乙烯醇復合凝膠（專利產品：ZL200410038808.5）由蘭州凱奇生物工程有限責任公司提供。

1.1.2 培養基

① PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、H2O 1000 ml，pH 值自然。

②玉米糖化醪：將粉碎好的玉米面加入到水中，兩者質量比為1：4，然后加熱到40℃時加入糖化酶，邊攪拌邊加熱，當溫度升到90℃時再加入淀粉酶，保溫糖化2 h，最后冷卻。

③共固定化細胞增殖培養基：PDA培養基與玉米糖化醪的混合培養基，PDA培養基和玉米糖化醪的體積比為1：1，其中馬鈴薯和玉米面的量加倍，其他不變，pH值調到4.5。

1.2 方法

1.2.1 多菌種共固定化方法

待固定的菌種經麥芽汁液體培養基增殖培養15～20 h，菌懸液中細胞濃度達到1.2億個/ml以上時，將產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、啤酒酵母、產脂酵母四種菌懸液按照1：1：1：1的體積比混合，然后以2：8的體積比與聚乙烯醇復合凝膠混合，攪拌均勻后置于低溫冷凍冰箱中固化48 h，解凍后切成4 cm×4 cm×4 cm的塊狀備用。

1.2.2 固定化細胞增殖培養

將備用固定化細胞載體加到共固定化細胞增殖培養基中，在30℃溫度條件下增殖15～18 h，增殖罐攪拌轉速90 r/min。

1.2.3 分析方法

①粗蛋白質含量測定：采用凱氏定氮法；

②細胞計數：采用血球計數板法；

③ 含水量測定：取一定量（W1）樣品于105℃烘箱中干燥2 h，然后測定樣品質量W2，按照下面公式計算：W=(W1－W2)/W1×100%。

1.2.4 生物飼料生產工藝

2 結果與討論

2.1 多菌種共固定化條件的研究

2.1.1 PVA復合凝膠含量對共固定化細胞的影響

載體強度直接影響到共固定化細胞應用周期的長短及應用效果的好壞，由于載體在流體狀態下受到不同方向的剪切力及與罐內壁和攪拌槳不斷碰壁，若載體強度不夠很容易破碎，故本實驗通過改變PVA復合凝膠含量，考察其對固定化載體強度及固定于載體內的細胞數等的影響來確定合適的PVA添加量，結果如圖1所示。

圖1 PVA復合凝膠含量對共固定化細胞的影響

圖1結果顯示，隨著PVA含量的增加載體強度隨之增大，而孔隙度減少，同時固定于載體內和增殖液中的細胞濃度也隨之增加，當PVA含量達到10%～12%時，固定于載體內和增殖液中的細胞濃度也達到最高值，即1.2億個/g和1.0億個/ml，說明PVA含量越高載體強度就越大，載體承載細胞是有限度的，無法承載的細胞就會脫落，故PVA最適含量為10%～12%。

2.1.2 懸浮細胞濃度對共固定化細胞的影響

對共固定化細胞來說，影響其作用效果的原因除了上述載體強度外，還有固定在載體中的活細胞數，即單位載體內所固定的細胞數，以及細胞活性等。實驗中菌懸液濃度分別為 0.1、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0億個/ml等幾個濃度梯度，通過測定增殖液中的細胞發芽率高低來選擇共固定化細胞的最適菌懸液濃度。結果如圖2所示。

圖2 懸浮細胞濃度對共固定化細胞的影響

圖2結果顯示，隨著懸浮液細胞濃度的增大，固定于載體內的細胞數隨之增加，增殖液中的細胞發芽率也隨之升高，當細胞濃度1.0億個/ml時發芽率最高為25%，隨后維持在20%～22%。故選擇懸浮液細胞濃度1.0億個/ml為最佳固定量。

2.1.3 共固定化增殖培養條件的確定

由于固定于PVA復合凝膠載體內的細胞不是單一菌種，而是4種混合菌種，而且各個菌種的最適培養條件不盡相同，故本實驗根據各個菌種的培養特點，通過正交實驗選擇合適的共固定化細胞增殖培養條件，即最適溫度、轉速、培養基pH值以及適宜的培養基，結果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果與分析

從表2可以看出，影響共固定化細胞增殖培養的條件依次為 A(溫度)＞B（搖床轉速）＞C（pH 值），其最佳方案為A2B2C2,即培養溫度30℃，搖床轉速100 r/min及最適pH值為4.5。

表3 增殖培養基的選擇

表3結果顯示，利用單一的培養基作為共固定化細胞的增殖培養基沒有玉米糖化醪和PDA混合培養基好，考慮到原料成本，生產中選擇利用玉米糖化醪和PDA的混合液作為共固定化細胞的增殖培養基。

2.2 共固定化細胞在生物飼料發酵中的應用研究

將增殖好的混合細胞及培養好的綠色木霉和米曲霉的混合菌液按比例接入到固態物料中，配料（初始蛋白質含量為10%～12%）含水量62%左右。增殖培養條件：培養溫度30℃，搖床轉速100 r/min及最適pH值為4.5，具體工藝操作如1.2.3節所述進行，主要考察共固定化細胞的重復使用批次和成本對比。

2.2.1 重復批次

共固定化細胞經活化后置于專門的增殖罐中進行增殖培養，增殖培養基為1000 L，固定化細胞載體的添加量為10%，每批測定增殖細胞數和產品中粗蛋白質含量，結果如圖3所示。

圖3 共固定化細胞重復使用批次

從圖3中看出，前6批次增殖液中的細胞濃度較低，均在1.0億個/ml以下，從第7批開始細胞濃度達到或超過1.0億個/ml以上，產品粗蛋白含量（含水率12%～15%）亦能維持在18%以上，最高時達到35%；中間偶爾出現細胞濃度低于1億個/ml，此時可以向增殖罐中添加適量無機鹽，而后細胞濃度又可恢復到原來水平，即便到了15批以后細胞濃度也能維持此水平；產品粗蛋白質含量基本保持在20%以上。跟蹤實驗表明該固定化細胞可以連續使用1年，結果表明該固定化細胞具有較好的操作穩定性和重復性；同時也說明固定化細胞技術具有篩選優勢菌種的作用，即在固定化細胞重復利用過程中那些具有較高活力的細胞能夠存活下來，而老化或活力較低的細胞則被淘汰。

2.2.2 增殖細胞發酵生產生物飼料與傳統游離細胞的成本對比

利用固定化細胞技術可以省去菌種的擴培操作，不但節省了大量培養時間，而且還節約了原料和降低了費用。由于成本差額主要由前期種子培養工序形成的，所以主要對比這部分的成本，包括原料成本、能源成本及人工成本等。對于一個年產1000 t的生物飼料生產企業，生產天數300 d，則成本核算如下：

共固定化細胞技術：主要由載體成本、增殖罐制造成本、人工成本和水電成本構成。其中載體成本：25元/kg×100 kg=2500元，增殖罐制造成本：制造成本10萬元左右，使用期限15年，則分攤到每年的成本為6700元,人工成本：1100元/月×12月×1人=13200 元,水成本：0.5 方/d×300 d×2.5 元/方=375元,電成本：400 元。則成本總和=2500元+6700元+13200元+375元+400元=23175元。

傳統工藝技術：主要由原料成本、人工成本及水電成本構成。其中人工成本：1100 元/(人·月)×12月×3人=39600 元，水成本：3 方/d×300 d×2.5 元/方=2250元，電成本：1.5 kw×24 h×300×2.5 元/(kw·h)=5400 元，則成本總和=39600元+2250元+5400元=47250元。

則利用共固定化細胞技術進行生物飼料發酵生產要比傳統工藝技術節省生產成本：(47250元－23175元)/47250元×100%=51%，由此可見利用固定化細胞技術具有較強的競爭優勢和較好的應用前景。

若干篇，刊略，需者可函索）