高效液相色譜法檢測飼料中咪達唑侖的含量

趙 燕 趙建元， 楊曙明 魏 濤

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081；2.北京聯合大學應用文理學院，北京 100083）

咪達唑侖（midazolam）是臨床常用的含咪唑環的苯二氮草類藥物，具有抗焦慮、驚厥、肌肉松弛、順序性遺忘以及催眠的作用，目前廣泛應用于麻醉領域[1]。另外，咪達唑侖具有脂溶性高，半衰期短的特點[2－5]。咪達唑侖是一種鎮定安定劑，將其添加入飼料可以促使動物入睡，從而產生促增重作用。由于咪達唑侖作為增重劑效果好，經濟回報高，部分違法者在畜禽養殖過程中使用咪達唑侖作為飼料添加劑，導致咪達唑侖可能會殘留在各種食用組織中，人食用此類動物產品后，會表現出惡心、嘔吐、頭暈無力等現象，過量中毒可出現昏迷、心跳過速等癥狀，人久吃則會產生耐藥性。我國農業部第176號公告中指出，禁止在飼料中使用咪達唑侖，而我國尚未出臺有關飼料中咪達唑侖的檢測方法。因此，迫切需要通過系統的研究建立飼料中咪達唑侖的檢測方法，從而促進飼料規范生產和科學利用，為促進我國畜牧業發展，飼料產業提升提供技術支持。截止目前，關于飼料樣品中的咪達唑侖的檢測方法報道不多，尤其是用于飼料樣品中咪達唑侖殘留量測定的儀器分析確證方法鮮有報道[6]。國內外有關咪達唑侖的研究不多，且多數集中在對血漿中的殘留測定方面，未涉及到飼料中咪達唑侖含量的測定[7－8]。本文建立了高效液相色譜法測定飼料中咪達唑侖含量的方法，操作簡單、快速、準確、成本低。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬配合飼料、豬預混合飼料、豬濃縮飼料均取自國家飼料質量監督檢驗中心（北京）。乙腈、甲醇為色譜純。水為Millipore超純水，標準品純度>99%，標準儲備液為用甲醇配成的濃度為1 mg/ml的咪達唑侖，置于棕色瓶中在-80℃下保存。將儲備液用甲醇繼續稀釋，制成濃度為1、10 μg/ml的標準工作液，4℃避光保存。

1.2 儀器與設備

分析天平，感量0.0001 g；垂直振蕩器；高速冷卻離心機；氮吹儀;旋渦混合儀；固相萃取柱（waters,C18-3cc-200 mg）；1 ml針頭過濾器（備有 0.45 μm 的微孔濾膜）；高效液相色譜儀（Waters2695，配有紫外檢測器2998）。

1.3 試樣的處理

1.3.1 提取

準確稱取1 g飼料樣品（配合飼料、預混合飼料及濃縮飼料），置于50 ml的聚丙烯離心管中，加入5 ml乙腈提取液，垂直振蕩10 min使其混勻，后于12000 r/min，4℃條件下離心10 min，轉移上清液至10 ml聚丙烯離心管中。向試樣中再加入5 ml試樣提取液，重復提取1次。合并兩次上清液，40℃下將上清液用氮氣吹至近干，1 ml的甲醇漩渦振蕩溶解備用。

1.3.2 凈化

準確移取上述飼料試樣各1 ml，再加2 ml水漩渦混勻。注入已用3 ml甲醇和3 ml水活化過的C18固相萃取小柱，然后用3 ml水淋洗，再用2 ml甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮氣吹至近干，1 ml甲醇漩渦混合溶解，過0.45 μm的微孔濾膜，濾液在HPLC上測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：溶劑A甲醇+溶劑B超純水；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μl；柱溫：30℃。流動相梯度及洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結果

2.1 校準曲線

在已提取凈化好的飼料空白溶液中添加適量的標準工作液，在本實驗確定的色譜條件下，從低濃度到高濃度依次進樣，按其所得峰面積(縱軸)與對應的咪達唑侖濃度(橫軸)做標準曲線，計算出回歸方程和相應系數。試驗測得咪達唑侖溶液濃度在1.00～10.00 μg/ml范圍內線性良好：豬配合飼料線性回歸方程為Y=47558X-1469.5，相關系數為R2=0.9976；預混合飼料線性回歸方程為Y=49293X-272.47，相關系數為R2=0.9954；濃縮飼料線性回歸方程為Y=44482X-5867.4，相關系數為R2=0.9979。標準曲線見圖1～圖3。

圖1 豬配合飼料標準曲線

圖2 豬預混合飼料標準曲線

圖3 豬濃縮飼料標準曲線

2.2 定量限

依據液相色譜目標峰信噪比S/N>10確定方向定量限，測得飼料中咪達唑侖的定量限為1.0 mg/kg。

2.3 方法加標回收率及精密度試驗

采用在空白飼料樣品中添加目標化合物的方法測得回收率,每種飼料平行測定3次，連續進樣3 d，測定結果見表2～表4。由表可知，在1.0 mg/kg的標準添加水平下，豬配合飼料回收率為70%～100%，豬預混合飼料回收率為60%～100%，豬濃縮飼料回收率為65%～100%；相對標準偏差均小于10%。重復性及再現性良好。

表2 豬配合飼料中咪達唑侖添加回收率結果(%)

表3 豬預混合飼料中咪達唑侖添加回收率結果(%)

表4 豬濃縮飼料中咪達唑侖添加回收率結果(%)

3 討論

3.1 前處理方法的確定

本標準用于測定飼料中咪達唑侖的含量，但飼料中復雜的基質使得進行液相色譜測定時干擾極大，因此在進行檢測前選擇良好的前處理方法是十分必要的。

3.1.1 提取條件的確定

由于咪達唑侖易溶于乙腈、甲醇以及乙酸乙酯等有機溶劑，實驗嘗試用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙醇六種溶液提取飼料樣品中的咪達唑侖，并進行高效液相色譜分析。結果表明，用正己烷、丙酮、乙醇提取時，提取效果不好；用乙酸乙酯提取時，雖回收率較高，但提取液在咪達唑侖出峰位置附近有很強的雜峰干擾，無法準確定量；用甲醇提取時，雖與雜峰分開，但回收率較低。用乙腈提取時，咪達唑侖提取完全，回收率較高，雜峰干擾小，所以我們選擇乙腈為提取溶劑。乙酸乙酯提取色譜見圖4。

圖4 乙酸乙酯提取配合飼料空白、添加及標準品比較

3.1.2 凈化方法的確定

本方法采用固相萃取柱凈化樣品提取液。由于咪達唑侖極性較弱，選用C18柱和硅膠柱進行凈化。實驗結果表明，硅膠柱不能除去目標峰附近的雜峰干擾，而C18柱的分離效果較好，且回收率高，因此最終確立采用C18柱對飼料提取液進行固相萃取。

3.2 檢測波長的確定

對標準工作液在200～400 nm以1 nm間隔掃描，測得咪達唑侖的最大吸收波長為223 nm。在實驗過程中發現，223 nm波長處始終有雜峰干擾，無法去除。但此雜峰在254 nm波長時無紫外吸收，且分離良好。因此確定254 nm為最佳檢測波長。

3.3 液相色譜柱的確定

由于咪達唑侖極性較弱，試驗中嘗試選用C18色譜柱進行測定，但因飼料基質中雜質眾多不能在前處理中完全凈化，用150 mm的C18色譜柱檢測時分離度較低，干擾大，無法準確定量；用250 mm的C18柱檢測時分離度明顯增強，因此選擇250 mm的C18柱進行檢測。

3.4 流動相比例及梯度的確定

C18色譜柱為反相柱，實驗時一般采用水、甲醇、乙腈等強極性溶劑作為流動相，實驗表明咪達唑侖在甲醇的溶解度高，因此采用水+甲醇作為流動相進行測定。當甲醇比例大于58%時，目標峰出峰時間較早與雜峰分離度低；比例小于58%目標峰與雜峰難以分離。因此選用58%甲醇+42%的水作為流動相初始比例。又因在飼料提取過程中，乙腈提取出大量脂溶性雜質，使得樣品中有大量殘留，無法被58%甲醇流動相完全洗脫，為保證結果的穩定性，延長色譜柱使用壽命。故在目標峰保留時間之后將流動相中甲醇比例變化為100%，以清洗色譜柱中殘留的大量脂溶性雜質。圖5～圖10為確定色譜條件下3種飼料的空白及標準添加色譜圖。

圖5 豬配合飼料空白樣品色譜

圖6 豬配合飼料咪達唑侖添加色譜

圖7 豬預混合飼料空白樣品色譜

圖8 豬預混合飼料咪達唑侖添加色譜

圖9 豬濃縮飼料空白樣品色譜

圖10 豬濃縮飼料咪達唑侖添加色譜

4 結論

本實驗中所確立的檢測方法適用于豬配合飼料、豬預混合飼料、豬濃縮飼料中咪達唑侖含量的測定，通過對儀器色譜條件及前處理條件的優化，以及采用C18固相萃取柱對樣品提取液的凈化，使得方法的靈敏度、精確度均能滿足日常分析的要求，且具有檢測成本低，操作簡單，檢測效率高等特點。

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