固態發酵豆粕蛋白質品質評價指標的研究

單達聰 王四新 季海峰 劉 輝

（北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097）

經過微生物固態發酵的豆粕其物質成分發生了很大的變化，檢測指標很多，概括起來包括感官指標、技術指標、安全指標和衛生指標。單純從技術指標就有很多，全面檢測非常費時費力，也難以應用到實際生產的產品質量評價標準中。因此確定關鍵性的少數技術指標用于發酵豆粕品質的快速評價是非常重要的研究內容。固態發酵豆粕的主要目的是鈍化或消除其抗營養因子，其中最主要的是通過發酵處理降解蛋白質類抗營養因子，如7S和11S蛋白、胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素，使之失去抗營養作用。同時，在降解大分子蛋白質的過程中還可以積累大量的肽和游離氨基酸，從而提高豆粕蛋白質的消化吸收率和動物健康水平。但在發酵過程中部分氨基酸會被脫羧酶和氨基轉移酶分解，積累一定量的胺類等含氮物，而降低豆粕的飼用價值。在發酵豆粕應用于仔豬日糧實踐中，曾出現仔豬腹瀉增多、生長性能下降等負面情況也證明了這一點。固態發酵豆粕生產工藝中，不同生產批次間品質不穩定性影響飼養效果，且表現突出，因此發酵豆粕品質的批次檢驗評價尤為重要。目前鮮見發酵豆粕品質評價關鍵技術指標的研究報道。以發酵豆粕含氮物檢測指標間的相關性及其與飼養效果的關系兩個角度，開展兩個試驗進行相關研究，為確定發酵豆粕簡單、準確的技術評價指標提供科學依據。

試驗一：發酵豆粕檢測指標相關性研究。

1 材料和方法

1.1 菌種和豆粕

米曲霉（Aspergillus oryzae），孢子干粉制劑，孢子含量≥5×109個/g。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），干粉制劑，活菌數≥2×1010cfu/g。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，干粉制劑，活菌數≥2×1010cfu/g。

豆粕，普通豆油生產工藝生產的帶皮豆粕，粗蛋白含量44%。

1.2 設施、設備與儀器

發酵溫室；不銹鋼發酵曲盤、可密封塑料袋；全自動定氮儀、酸度計、高效液相色譜儀、分析天平。

1.3 試驗設計與操作方法

以最常用的發酵菌種和發酵方式組合，獲得不同蛋白質水解度的樣品，研究豆粕蛋白質降解各項指標的相關性。具體發酵處理方法見表1。

表1 固態發酵豆粕處理工藝參數

采用固態淺盤發酵工藝，好氧與厭氧結合連續進行。8個處理，3次重復共24個樣品，每樣品風干基礎豆粕2000 g，干粉菌種接種量0.3%，加水量料水比1：0.8。接種、加水、混合均勻后裝入不銹鋼淺盤加透氣蓋，置30℃溫室好氧發酵結束時，混合均勻后轉入塑料袋排氣密封，置于38℃溫室，厭氧發酵與酶解。總時間達到18 h后結束發酵，檢測樣品。

1.4 檢測指標與方法

總氮（TN，%）和粗蛋白（CP,%）含量采用食品安全國家標準《食品中蛋白質的測定GB/T 5009.5—2010》第一法中的自動凱氏定氮儀法；

揮發性鹽基總氮（TVBN，mg/100 g），半微量凱氏定氮法；

游離氨基酸（FAA，%）和總氨基酸（TAA，%）含量測定采用高效液相色譜法（HPLC法）；

酸溶蛋白（TCA－SP,%）和肽含量(%)，采用國家標準《大豆肽粉GB/T 22492—2008》方法。

1.5 相關系數計算方法

相關系數計算采用Mcrosoft Excel XP的數據分析功能進行。

2 結果與分析

發酵豆粕品質的穩定性是保證飼養效果的重要內容，實際生產中出現的問題，由于不同工藝參數和不同批次造成產品飼養效果差異很大的現象屢見不鮮。從表2可見，試驗設置的發酵工藝參數的不同對豆粕蛋白質降解技術指標形成了系列梯度，其中揮發性鹽基氮、游離氨基酸和蛋白質水解度指標系列的變異系數很大，分別為116.2%、97.6%和35.2%；但酸溶蛋白質和肽含量的變異系數較小，分別為20.1%和13.1%，而粗蛋白質含量和總氨基酸含量的變異系數很小，分別為1.5%和4.5%。從不同的發酵工藝參數和批次影響發酵豆粕品質穩定性的角度看，變異系數較大的指標更適合用于其品質的評價，顯然TVBN、FAA、DH更適合，而CP和TAA則不是重點。從營養和免疫技術的角度看，肽含量是很重要的指標，但其變異系數較小而相對穩定，也就是說其檢測的重要性處于中等水平。

各指標間的變化趨勢是否相同或相關是簡化檢測指標的重要方法。各指標間的相關系數見表3。

表2 發酵豆粕蛋白質水解指標檢測結果

表3 發酵豆粕蛋白質水解度及其產物含量相關系數

分析表3可見，發酵豆粕蛋白質水解度與鹽基氮含量、酸溶蛋白含量、游離氨基酸含量均呈現高度正相關，相關系數分別為 0.9611、0.8184、0.9533，均為極顯著正相關（P＜0.01）；但與粗蛋白質含量、肽含量和總氨基酸含量則呈現較低的正相關，均沒有達到顯著水平（P＞0.05）。可見，隨蛋白質水解度提高，豆粕中蛋白質類抗營養的大分子物質被水解為小分子時，累積的蛋白質水解產物，如酸溶蛋白質、游離氨基酸和鹽基氮隨之顯著增加；但粗蛋白質、總氨基酸和肽含量不一定隨之增加或穩定在某一基本水平，其中粗蛋白質含量穩定在50%左右，總氨基酸含量穩定在46%左右，肽含量變化稍大（4.17%～6.03%）。

試驗二：蛋白質水解度和揮發性鹽基總氮對仔豬飼養效果的影響

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將5種不同蛋白質水解度和鹽基氮含量的豆粕作為試驗材料。①普通豆粕，惠福糧油集團有限公司生產，DH=2.24%，TVBN=10.4 mg/100 g；②發酵豆粕A，DH=4.70%，TVBN=186.0 mg/100 g；③發酵豆粕 B，DH=22.20%，TVBN=519.0 mg/100 g；④混合豆粕 A，即發酵豆粕A與普通豆粕1：1比例的均勻混合物，DH=3.47%，TVBN=98.2 mg/100 g；⑤混合豆粕 B，即發酵豆粕B與普通豆粕1：1比例的均勻混合物，DH=12.22%，TVBN=264.7 mg/100 g。DH和TVBN的檢測方法同試驗一。

1.2 試驗動物與分組管理

試驗動物為長大雜交一代35日齡斷奶健康仔豬60頭，體重相近，公母各半。隨機分為5組，分別作為對照組和試驗1、2、3、4組；每組 12頭，分3圈飼養，每圈4頭為一個重復。試驗期35 d。網床圈欄，自由采食，自由飲水，舍溫20～22℃。專人飼養，每天清掃衛生，記錄喂量，觀察腹瀉。試驗開始和結束稱重，每周結料。

1.3 試驗日糧組成

對照組仔豬日糧配方為：玉米60%、普通豆粕19%、麥麩6.0%、魚粉5.0%、乳清粉4.0%、豆油2.0%、預混料4.0%。以試驗材料②、③、④、⑤分別替代基礎日糧配方中的普通豆粕，依次配制試驗1、2、3、4組的仔豬日糧，并制成顆粒飼料。粗蛋白含量：對照組和試驗 1、2、3、4 組分別為 17.5%、17.6%、17.8%、17.5%、17.5%。

1.4 檢測指標與方法

日增重(g/d)：測定試驗開始和結束時仔豬體重,增重總量與試驗天數的比值即日增重；采食量(g/d)；飼料增重比(F/G)：耗料與增重的比值；腹瀉率(DR，%)：每天清晨觀測記錄仔豬腹瀉現象，1頭1次記為腹瀉1頭日,仔豬腹瀉頭日數與試驗豬總飼養日數的比值。

1.5 數據處理

采用SPSS13.0統計軟件，進行方差分析和鄧肯法多重比較。統計分析結果表示方法：均值±標準偏差；肩標字母表明均值差異比較結果，小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）,大寫字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

生產性能指標與腹瀉率試驗結果見表4。

表4 試驗仔豬日增重、采食量、料重比及腹瀉率

2.1 日增重

表4中試驗組與對照組日增重比較，試驗1～4組依次為 542、420、377、410 g/d，均高于對照組（343 g/d），分別提高58.0%、22.4%、9.9%、19.5%，其中試驗1組極顯著高于對照組（P＜0.01），可見發酵豆粕替代普通豆粕可提高仔豬日增重；試驗組之間比較，試驗1組高于試驗 2組（542 對 420 g/d，P＜0.05），表明發酵豆粕A優于發酵豆粕B；試驗3組均值低于試驗4組(377對 410 g/d，P＞0.05)，表明當發酵豆粕和普通豆粕按1：1的比例混合使用時，發酵豆粕A和發酵豆粕B沒有顯著差異；試驗1組極顯著高于試驗3組（542對377 g/d，P＜0.01），試驗2組和試驗 4組沒有顯著差異（420對410 g/d，P＞0.05）。綜合上述結果可見：發酵豆粕優于未發酵豆粕；發酵豆粕蛋白質水解度過高會導致鹽基氮過高，發酵豆粕與未發酵豆粕按1：1混合應用，兩種情況均會降低發酵豆粕的飼養效果。

分析表5及圖1，隨豆粕蛋白質水解度提高仔豬日增重先提高后下降，呈現二次函數趨勢，以DH=4.7%時日增重最高；從表5和圖2可見，隨著豆粕的鹽基總氮含量的提高，日增重的變化同樣呈現二次函數趨勢，且與蛋白質水解度和日增重的關系方向相同，結合兩指標的性質有理由認為：隨著豆粕蛋白質水解度的提高，鹽基總氮隨之上升，仔豬的耐受性在鹽基總氮達到186 mg/100 g時達極限，超過該值時日增重開始下降。

表5 仔豬日糧豆粕蛋白質水解度、揮發性鹽基氮與日增重、料重比比較

圖1 蛋白質水解度與日增重的關系

圖2 鹽基總氮與日增重的關系

2.2 采食量和料重比

比較表4中各組試驗仔豬采食量，試驗組1、2組比對照組分別提高32.2%、12.0%，表明發酵豆粕可提高采食量，但發酵豆粕A優于發酵豆粕B；試驗3、4組與對照組基本持平（－4.0%、3.6%），將發酵豆粕與普通豆粕按1：1比例混合使用則效果降低。分析表4中的料重比，試驗 1、2、3、4組均優于對照組，分別為（F/G）1.51、1.65、1.57、1.56 對 1.80，比對照組分別降低16.1%、8.3%、12.8%、13.3%，表明發酵豆粕可提高飼料利用率；試驗1組、2組之間比較，發酵豆粕A優于發酵豆粕B（1.51對 1.65）。

2.3 腹瀉率

從表4中可見，試驗1、2、3、4組和對照組的全程腹瀉率分別為(DR)5.3%、13.9%、12.5%、21.1%、24.3%，與對照組相比分別降低77.9%、42.7%、48.5%、13.3%，各試驗組仔豬腹瀉率均明顯低于對照組，表明發酵豆粕可明顯降低仔豬腹瀉率。發酵豆粕A優于發酵豆粕B,表明發酵豆粕過高揮發性鹽基總氮含量(186對519 mg/100 g)可導致腹瀉率增加；試驗1組和試驗3組比較（5.3%對12.5%），試驗2組和試驗4組比較 (13.9%對21.1%),分別降低腹瀉率57.6%和34.1%，表明發酵豆粕和普通豆粕按1：1混合使用同樣可以降低仔豬腹瀉率，但效果下降。

3 小結與討論

蛋白質的功能活性與其分子結構和分子量存在直接關系，豆粕中蛋白質類抗營養因子的抗營養作用因為發酵水解而形成酸溶蛋白和游離氨基酸等產物，使其降低或消除。豆粕蛋白質水解度反映出蛋白質大分子水解為小分子或游離氨基酸的程度,該指標與發酵豆粕酸溶蛋白質含量具有極顯著的正相關(r=0.8184,P＜0.01)，而肽含量與酸溶蛋白質含量存在顯著的正相關（r=0.7184，P＜0.05），所以使用酸溶蛋白質含量指標評價發酵豆粕蛋白質品質時，既可以反映豆粕中抗原蛋白質和其它蛋白質抗營養因子被水解的程度，進而揭示了該類抗營養因子活性被消除的程度，同時又可一定程度上反映肽含量的高低，所以酸溶蛋白質含量是評價發酵豆粕品質的較好且重要的指標。從另一個角度看，隨著蛋白質水解度的提高，水解產生的游離氨基酸單體被脫羧酶催化脫羧產生胺類化合物，鹽基氮含量隨之提高，因此過高的蛋白質水解度可能導致豆粕中原有氨基酸被破壞而降低飼養效果，同時過高的揮發性鹽基氮還可能造成負面影響。

從對實際飼養效果的影響看，蛋白質水解度和鹽基總氮含量交互影響仔豬的日增重等生產性能指標。蛋白質水解度過低和過高都會降低飼養效果，該指標適宜值的范圍在3.47%～12.2%；試驗結果表明，發酵豆粕鹽基氮含量也直接影響到飼養效果，過高的鹽基氮會降低仔豬的生產性能指標，該指標值的適宜范圍應低于186 mg/100 g。受本飼養試驗設置梯度的影響，具體蛋白質水解度（或酸溶蛋白質含量）和鹽基氮含量的優化數據值應進一步研究。綜合上述試驗結果可見，酸溶蛋白質（或蛋白質水解度）和揮發性鹽基總氮含量可以作為從正反兩個方向評價發酵豆粕蛋白質品質及其對飼養效果的影響，因此可以選擇這兩個指標作為評價發酵豆粕蛋白質品質的主要指標。

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