兔源益生菌Tu-115菌株鑒定及其產纖維素酶固體發酵條件優化

尚 偉 姜軍坡 王世英 朱寶成

纖維素酶由起協同作用的葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶、β-葡聚糖苷酶等3個主要組分組成，它可將纖維素降解產生葡萄糖，并可進一步發酵生產酒精、SCP飼料蛋白、有機酸等物質，對緩解全球能源危機、飼料資源緊張、保護環境等具有很重要的意義[1-2]。細菌和真菌都可以產生纖維素酶；細菌主要產中性纖維素酶和堿性纖維素酶[3]，較真菌纖維素酶具有更好的耐堿、耐熱性，更適于工業生產，因此，細菌纖維素酶已成為研究的熱點[4]。

通常細菌纖維素酶的產量較少，篩選高產纖維素酶的細菌菌株并采用合理、有效的發酵方式使得纖維素酶各組分呈現較佳的協同作用，提高細菌產生的纖維素酶量，對于細菌纖維素酶的應用具有重要意義。葉明等[5]從土壤中篩選出產纖維素酶的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）B1菌株，并通過經微波-硫酸二乙酯復合誘變得到具有較高產纖維素酶活能力的正突變菌株B1-1，優化發酵條件后纖維素酶活可以達到0.436 IU/ml。呂靜琳等[6]從腐爛朽木中篩選得到高產纖維素酶的Bacillus cereus LT3菌株，用20 g/l甘蔗渣，pH值7.0、30℃培養120 h，CMC酶酶活為71.17 U/ml，濾紙酶酶活為33.37 U/ml。侯進慧等[7]從農田、農產品果實表面篩選出一株產低溫纖維素酶活力較高的Bacillus cereus T34菌株，優化后纖維素酶酶活達到1.43 U/ml。Lee等[8]在7 L的生物反應器中對從海洋中篩選的Bacillus subtilis subsp.subtilis A-53菌株產羧甲基纖維素酶的液體發酵條件進行了優化，在7 L和100 L的生物反應器中產生的纖維素酶的量分別可以達到150.3和196.8 U/ml。胡青平[9]對細菌菌株Z1產纖維素酶的條件進行了優化，CMC酶活力最高可達1325 μg/(ml·min)，濾紙酶活力最高可達93.8 μg/(ml·min)。

Tu-115菌株是本研究組從兔子盲腸中篩選得到的一株既具有抑制大腸桿菌活性，又可在胞外大量產生纖維素酶的優良菌株。本研究欲測定Tu-115菌株的生理生化特性，并對其進行16S rDNA序列分析，以鑒定其種屬。分別以CMC和濾紙為底物測定纖維素酶比活力，采用單因素試驗考察發酵培養基的碳源、氮源、碳氮比例、麩皮粒度、溫度、發酵時間等因素對該菌株產纖維素酶的影響；以濾紙為底物測定纖維素酶比活力，采用正交試驗考察培養基料水比、接種量、培養基初始pH值及裝瓶量等因素對Tu-115菌株產纖維素酶的影響，以確定Tu-115菌株固體發酵產纖維素酶的最適條件，為該菌株應用于纖維素酶生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

Tu-115菌株，由本實驗室分離保存。

Mandel's無機鹽營養液及DNS試劑配制方法參考文獻[10]。

芽孢桿菌種子培養基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Mandel′s無機鹽營養液 100 ml，自然 pH 值。

基礎發酵培養基：蛋白胨 2 g、蔗糖 2 g、Mandel′s無機鹽營養液8 ml，自然pH值。

ZHWY-2112B型雙層搖床，上海智誠分析儀器有限公司生產；GL-21M型高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產；Labo Autoclave型高壓滅菌鍋，日本Sanyo公司生產；AIR TECH超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司生產；SPX-250型智能生化培養箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠生產；BS 214 D型分析天平，德國Sartorius公司生產；6405紫外-可見分光光度計，英國Jenway公司生產。

1.2 方法

1.2.1 Tu-115菌株鑒定

1.2.1.1 菌株形態特征及生理生化特征的測定

菌株形態特征及生理生化特征測定依據東秀珠等《常見細菌系統鑒定手冊》[11]。

1.2.1.2 16S rDNA序列分析

采用通用引物27F/1492R進行16S rDNA的PCR擴增，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成并進行測序。將所得序列與GenBank數據庫中序列進行BLAST分析，并選取相似性較高的標準菌株用MEGA 4.1以Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.2.2 發酵條件對Tu-115菌株產纖維素酶影響的測定

挑取菌種，接種于種子培養基中，裝瓶量為100 ml/250 ml。于200 r/min，37℃，搖床培養12 h后使用。

基礎發酵條件為：在250 ml的三角瓶中放入4.0 g發酵底物（除另有說明外，碳源2.0 g和氮源2.0 g），8 ml營養液，Tu-115菌株種子液2 ml，30℃下培養48 h。

測發酵物的質量，與發酵前加入的培養基質量比較。向三角瓶中加入一定體積的蒸餾水，室溫下浸泡1 h，期間不斷攪拌?；靹蚝笕? ml加入EP管中，12000 r/min離心5 min，取上清液測定酶活力。取樣后，測定三角瓶中殘余發酵液的體積。分別測定出每1 g發酵物中含有的纖維素酶活力和每瓶發酵物中含有纖維素酶的總活力。

以CMC為底物測定纖維素酶活力的方法[12]：每1min催化CMC水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個CMC酶活力單位（IU）。

以濾紙為底物測定纖維素酶活力的方法[13]：每1 min催化濾紙水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個濾紙酶活力單位(IU)。

每個試驗設3次平行，每個平行測定2次，最后取平均值。根據試驗結果確定各因素的最適水平。每一個因素的優化都在上一個因素最優水平上進行。

1.2.2.1 單因素試驗分析

改變試驗條件，對產纖維素酶活力進行單因素分析：①分別以葡萄糖：麩皮(1：1)、麥芽糖：麩皮(1：1)、蔗糖：麩皮(1：1)、糖蜜：麩皮(1：1)、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、糖蜜、麩皮作為碳源，考察發酵培養基碳源的影響；②取最優碳源，按碳源：營養液=1：2加入Mandel's營養液，分別以尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4、KNO3、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏和豆餅粉作為氮源，稱取0.3 g，考察發酵培養基氮源的影響；③取最優碳源，按碳源：營養液=1：2加入Mandel′s營養液，再分別稱取最優氮源 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 g，考察發酵培養基碳氮比例的影響；④取最優碳源、氮源及碳氮比例，將麩皮粉碎，依次過20目、40目、60目和100目篩，按麩皮粒度從大到小的次序依次編號為1號、2號、3號、4號、5號麩皮粉末，分別取相應的麩皮粉末作為碳源，配制成發酵培養基，考察發酵培養基麩皮粒度的影響；⑤取最優碳源、氮源及碳氮比例，麩皮取最適宜粒度，接種后分別在28、30、32、35、37、40 ℃環境中培養，考察發酵溫度的影響；⑥取最優碳源、氮源及碳氮比例，麩皮取最適宜粒度，在最適溫度下發酵，從發酵24 h開始，每隔24 h抽樣進行酶活測定，直至240 h，考察發酵時間的影響。

1.2.2.2 正交試驗優化發酵條件

選取培養基料水比、接種量、培養基初始pH值、裝瓶量4個因素，設計4因素3水平L9（34）正交試驗進行產纖維素酶發酵條件優化。培養后，以濾紙為底物測定纖維素酶比活力，并進行比較。各試驗組數據均為3次平行試驗的平均值。

采用SPSS軟件對正交試驗結果進行極差（Range）分析和一般線性模型（General Linear Model，GLM）分析，以得出最佳培養基組成。若優化的最佳發酵條件未在正交表中出現，則平行測定最佳發酵條件和正交表中最佳條件下對應的纖維素酶比活力，重復6次，進行驗證。

2 結果與分析

2.1 Tu-115菌株鑒定結果

2.1.1 菌株形態特征及生理生化特征測定結果

Tu-115菌株生理生化特征測定結果（見表1）表明，該菌株呈現典型的芽孢桿菌屬生理生化特征。Tu-115菌株為革蘭氏陽性桿菌，菌體兩端平整，芽孢中生，見圖1（a）。在NB培養基上菌落為圓形，乳白色，表面光滑，有火山狀凸起，邊緣鋸齒狀，見圖1（b）。綜合以上結果可以初步將Tu-115菌株鑒定為芽孢桿菌。

表1 Tu-115菌株生理生化試驗的結果

圖1 Tu-115菌株革蘭氏染色結果及其菌落形態

2.1.2 16S rDNA序列系統發育分析

基于與Tu-115菌株同源性高的菌株和芽孢桿菌屬其他種的菌株構建系統發育樹，圖2所示，其中與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源性最高。Tu-115菌株與解淀粉芽孢桿菌的相似性高達99.16%（見表2）。結合其生理生化特征，可確定Tu-115菌株為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 芽孢桿菌Tu-115菌株的系統進化樹

表2 Tu-115菌株與幾種標準菌株的相似性比較

2.2 發酵條件優化結果

2.2.1 單因素試驗分析各因素對Tu-115菌株產纖維素酶的影響

由圖3（a）可知，在各個碳源組合中，麩皮對應的兩種纖維素酶比活力均較高，同時發酵物具有較高的纖維素酶總活力。由圖3（b）可知，同一氮源下分別采用CMC和濾紙為底物測定纖維素酶比活力，其結果相差較大，以兩種纖維素酶比活力同時較高者作為氮源較為適宜，故選取豆餅粉為最適宜氮源，此時發酵物呈現中等的纖維素酶總活力。由圖3（c）可知，當碳氮比為4：1時對應的兩種纖維素酶比活力均較高，此時發酵物呈現較高的纖維素酶總活力。

圖3 碳源、氮源及碳氮比對Tu-115菌株產纖維素酶的影響

由圖4（a）可知，當以1號麩皮粉末為碳源時，對應的兩種纖維素酶比活力均較高，并表現出較高的纖維素酶總活力；由圖4（b）可知，當培養溫度為35℃時，對應的兩種纖維素酶比活力均最高，同時具有較高的纖維素酶總活力；由圖4（c）可知，當發酵時間為144 h時，對應的兩種纖維素酶比活力均最高，并具有較高的纖維素酶總活力。

綜上所述，Tu-115菌株產纖維素酶的適宜條件為：以麩皮為碳源，豆餅粉為氮源，碳氮比為4：1，麩皮粒度在20目以上，在35℃靜置培養144 h。在此基礎上用正交試驗優化Tu-115菌株產纖維素酶固體發酵條件。

圖4 麩皮粒度、培養溫度及發酵時間對Tu-115菌株產纖維素酶的影響

2.2.2 正交試驗優化Tu-115菌株胞外產纖維素酶固體發酵條件

改變培養基料水比、培養基初始pH值、接種量、裝瓶量，進行正交試驗，對其結果進行極差分析和GLM分析，分析結果見表3、表4。

由表3可知，各因素水平影響的強弱順序為A2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1；各因素的主次順序為D＞B＞C＞A，即裝瓶量＞培養基初始pH值＞接種量＞培養基料水比。由表4可知，因素D和B，即裝瓶量和培養基初始pH值對試驗結果影響顯著，而因素A和C對試驗結果影響不顯著，各因素的主次順序為D＞B＞C＞A。綜上所述，A2B2C2D2為產纖維素酶的最佳發酵條件，與A1B2C2D2進行驗證試驗(見表5)，結果表明，以濾紙為底物時，A2B2C2D2對應的平均纖維素酶比活力為64.06 IU/g(n=6)，以CMC為底物時，A2B2C2D2對應的平均纖維素酶比活力為73.35 IU/g（n=6）；以濾紙為底物時，A1B2C2D2對應的平均纖維素酶比活力為60.95 IU/g（n=6），以 CMC 為底物時，A1B2C2D2對應的平均纖維素酶比活力為72.65 IU/g（n=6）。綜上所述，正交試驗優化出的發酵條件對應著較高的纖維素酶比活力，即最佳發酵條件為培養基料水比為1：1、培養基初始pH值4.0、接種量20%、裝瓶量4 g/250 ml。

表3 發酵條件正交試驗結果的極差分析

表4 發酵條件正交試驗結果的一般線性模型分析

3 結論與討論

3.1 結論

經鑒定，可在胞外產纖維素酶的Tu-115菌株為解淀粉芽孢桿菌。以麩皮為碳源，豆餅粉為氮源，碳氮比4： 1，料水比1： 1，接種量20%，初始pH值4.0，麩皮粒度大于20目，裝瓶量4 g/250 ml，在35℃靜置培養144 h時，可以達到較高的纖維素酶比活力。

3.2 討論

Tu-115菌株具有胞外產纖維素酶的特性，具有這種特性的細菌可以通過發酵條件的優化，增加其胞外分泌的纖維素酶量，增大其應用于工業生產的可行性。纖維素酶是一種多組分的酶系，各組分間又存在著協同作用。根據纖維素酶水解的協調理論，水解過程首先由內切葡聚糖酶作用于纖維素酶分子的非結晶區內部的β-1,4-糖苷鍵，產生的β-寡聚糖再被外切葡聚糖酶作用生成纖維二糖[14]，所以內切葡聚糖酶活力的大小很重要。以CMC為底物測定的纖維素酶活力表征的是內切葡聚糖酶活力；濾紙結構中包括結晶型纖維素和非結晶型纖維素，所以通常用以濾紙為底物測定的纖維素酶活力表征纖維素酶復合體系的總活力[15]；單因素優化中，同時采用分別以CMC、濾紙為底物測定的兩種纖維素酶比活力為指標，可以較好地評價纖維素酶的活力；正交試驗中，采用以濾紙為底物測定的纖維素酶比活力為指標，可以更真實地表征優化條件下產纖維素酶復合體系的活力。

表5 發酵條件正交試驗結果的驗證

解淀粉芽孢桿菌具有廣泛的抑制真菌和細菌的活性[16]，這和本研究組前期的結果相一致，Tu-115菌株具有抑制大腸桿菌等病原菌的活性。Lee等[17]從土壤中篩選出1株胞外產纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌DL-3菌株，并對其胞外產生的纖維素酶進行了純化和表征。國內尚未見該種屬細菌胞外產纖維素酶的報道。本研究采用固體發酵的方式，利用廉價的麩皮，在最優發酵條件下以CMC、濾紙為底物測定的兩種纖維素酶比活力分別可達73.35 IU/g和64.06 IU/g，CMC酶和濾紙酶活力基本相當，說明Tu-115菌株產的纖維素酶中內切葡聚糖酶和其他幾種纖維素酶組分的比例較為適宜，表現出較佳的協同作用，具有很高的應用潛力。

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