枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的發酵條件優化

黃璠 蔡俊

在我國，飼用酶制劑的開發與利用始于20世紀90年代[1]。多年來，人們發現蛋白酶對動物尤其是幼齡動物有著獨特的作用，目前飼料工業中應用的蛋白酶多為酸性蛋白酶，而不同pH值的蛋白酶對飼料作用的影響正成為飼料行業的一個研究熱點，已有相關報道，中性蛋白酶作為飼料添加劑有很好的效果[2－4]。但中性蛋白酶的產量低、成本高等因素限制了其大規模應用[5]。本研究以枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的發酵條件為研究對象，通過單因素試驗和正交試驗優化了產酶的發酵條件，取得了很好的效果，為進一步提高該菌產中性蛋白酶的能力奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

斜面培養基：蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化鈉5 g/l、瓊脂 20 g/l、水 1 L，pH 值 7.2～7.4。

種子培養基：液體斜面培養基。

發酵培養基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氫二鈉 4 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、水 1 L，pH 值 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 初始發酵條件

取活化好的斜面菌株，接種一環到一級種子培養基（50/250 ml），37℃、160 r/min培養14 h后，以3%(V/V)的接種量接入發酵培養基（50/250 ml），37℃、160 r/min培養48 h。

1.2.2 蛋白酶活力測定[6]

按國家標準(GB/T23527—2009)，采用 Folin－酚法測定中性蛋白酶活力。

1.2.3 發酵條件優化

1.2.3.1 發酵條件的單因素試驗

采用單因素試驗，分別考察裝液量、轉速、培養基初始pH值、發酵周期、接種量和發酵溫度對產酶的影響。裝液量(250 ml三角瓶中)分別為 30、50、70、90 ml；轉速分別取160、180、200和220 r/min；培養基初始pH值分別取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2；發酵周期分別取24、36、48、60、72 和 84 h；接種量分別取 1%、2%、3%、4%、5%；發酵溫度分別取33、35、37、39和 41 ℃。

1.2.3.2 發酵條件的正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，選取部分影響較大的因素（裝液量、初始pH值、發酵周期），進一步縮小范圍進行3因素3水平正交試驗，正交試驗因子與水平設計見表1。

表1 正交試驗因子與水平設計

2 結果與分析

2.1 不同單因素對發酵產中性蛋白酶的影響(見圖1～圖6)

圖1 裝液量對產酶的影響

由圖1可知，最優裝液量為50 ml。此時(即初始條件下)酶活為36.755 ml，由于裝液量小，培養基中的營養成分少，不利于產酶，且資源利用率低。裝液量大，可能對溶氧有一定的影響，枯草芽孢桿菌是好氧菌，也不利于產酶。

圖2 轉速對產酶的影響

由圖2可知，轉速為200 r/min時酶活最大，此時酶活為46.988 U/ml，隨著轉速的增大，酶活增大，說明轉速增大，溶氧增大，有利于產酶；當轉速大于200 r/min時酶活降低，可能是轉速繼續增大，對枯草芽孢桿菌本身有損害，從而使酶活降低。

由圖3可知，最優初始pH值為6.7，此時酶活為78.411 U/ml，pH值繼續升高，酶活降低，說明弱酸性培養基有利于菌株產酶；由圖4可知，最優發酵周期為60 h，此時酶活為86.987 U/ml；由圖5可知，最優接種量為4%，此時酶活為109.041 U/ml；由圖 6可知，最優發酵溫度為37℃，此時酶活為120.067 U/ml，溫度過低不利于菌體的生長和代謝產酶，溫度過高菌體易衰老而影響其正常的生長和代謝。

圖3 初始pH值對產酶的影響

圖4 發酵周期對產酶的影響

圖5 接種量對產酶的影響

圖6 發酵溫度對產酶的影響

2.2 部分發酵條件的正交試驗研究

由上述單因素試驗結果可知，裝液量、初始pH值和發酵周期對發酵產酶的影響較大，進一步縮小范圍，采用L9（33）正交設計法進行3因素3水平正交試驗，正交試驗直觀分析結果和方差分析結果分別見表 2、表 3。

表2 發酵條件正交試驗直觀分析結果

表3 方差分析結果

由表2可知，這3種因素對產酶的影響效果不同，其影響程度為：裝液量(ml)＞初始pH值＞發酵周期(h)，這3種因素對產酶影響都是顯著的，所得的最優組合為 A3B3C2，即裝液量 60 ml，初始pH值6.9，發酵周期60 h，恰好與正交表中的方案9一致，在此發酵條件下對產酶最有利，最大酶活為151.319 U/ml。

3 結論

通過發酵條件（裝液量、轉速、培養基初始pH值、發酵周期、接種量和發酵溫度）的單因素試驗以及裝液量、培養基初始pH值和發酵周期的正交試驗，得到了最優發酵條件為裝液量 60 ml，轉速200 r/min，初始pH值6.9，發酵周期 60 h，接種量4%，發酵溫度37℃。由正交試驗證明了裝液量、培養基初始pH值和發酵周期對產酶影響顯著。通過發酵條件的優化，酶活提高了311.7%。

[1]Bedford MR.Exogenous enzymes in monogastric nutrition－their current value and future benefits[J].Animal Feed Science and Technology,2000,86:1－13.

[2]凌寶明,馮定遠,左建軍.飼用蛋白酶的研究進展[J].飼料工業,2009,30(22):7－10.

[3]陳建明,葉金云,許堯興,等.飼料中添加中性蛋白酶對青魚生長、消化及魚體組成的影響[J].水生生物學報,2009,33(4):726－731.

[4]李艷麗,許少春,許堯興.中性蛋白酶高產菌株的篩選及產酶酶系分析[J].生物技術,2007,17(1):20－23.

[5]孫曉鳴,王萍,鄔向東.產中性蛋白酶芽孢桿菌配伍發酵響應面法研究[J].中國食品學報,2010,10(2):117－124.

[6]中華人民共和國國家技術監管局.GB/T23527－2009ICS67.220.22X69－2009,蛋白酶制劑[S].北京:標準出版社,2009.