預消化法酶解飼用海藻粉中非淀粉多糖的初步研究

王昌義 單守水 徐世艾

飼用海藻粉作為一種高營養價值的飼料添加劑，含有豐富的海藻多糖、蛋白質、脂肪、維生素、礦物質以及具有特殊功效的生理活性物質，其糖類含量在40%以上[1]，特別適合在海參等高附加值水產品的飼料中添加。目前，飼用海藻粉的使用還處于初級階段，在禽類、畜類以及水產養殖中[2-3]的少量應用均取得了一定的效果。但是，由于海藻細胞中的非淀粉多糖（NSPs）如纖維素、半纖維素、β-葡聚糖、果膠等不能被動物分泌的內源酶降解，產生了食糜黏度增加、營養屏障作用和微生物菌群數量增加等不利影響[4-6]，降低了飼用海藻粉的利用率。解決這一在植物性飼料源使用中普遍存在的問題的方法是在飼料加工過程中添加非淀粉多糖酶[7]來酶解其中的NSPs，經過與動物體內內源酶的協同作用提高飼料養分的消化利用率[8]，但是目前對于海藻粉中NSPs的酶解研究報道較少。為了充分發揮酶制劑對海藻粉的酶解作用，可以用預消化[9]的方法酶解NSPs。章世元等[10-11]對飼料的體外預消化進行了深入的研究，此方法可以避免傳統添加法[12]和后置噴涂法[13]中酶制劑活性降低或者不能充分發揮作用的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：飼用海藻粉（鼠尾藻粉），購于萊州市朱旺海參育苗場，80℃條件下烘干備用；纖維素酶(酶比活力 50000 U/g)、木聚糖酶(酶比活力 50000 U/g)、β-葡聚糖酶(酶比活力25000 U/g)、中溫淀粉酶(酶比活力3000 U/g)，酶制劑均購于肇東市酶制劑有限公司。

主要儀器：722E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司生產；HH-4型數顯恒溫水浴，江蘇省金華市榮華儀器制造有限公司生產；TDL-5-A臺式離心機，上海安亭科學儀器廠生產。

1.2 分析方法

還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）[14]。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶制劑最佳使用量的確定

配置不同酶活力梯度的纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中溫淀粉酶酶液。分別配置10%的海藻粉液20 ml，攪拌均勻后相應加入不同酶活力梯度的纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中溫淀粉酶酶液各2.00 ml，混合均勻后于40℃恒溫水浴中酶解60 min。酶解完成后經沸水浴滅活、3000 r/min離心、上清液定容后，用3，5-二硝基水楊酸法測定上清液中還原糖含量。確定纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中溫淀粉酶的最佳使用量。

1.3.2 酶制劑最適溫度范圍的確定

設置溫度梯度為 30、40、50、60、70 ℃。按照同樣步驟在不同溫度條件下以4種酶制劑的最佳使用酶活力進行酶解試驗，確定4種酶制劑酶解飼用海藻粉最適溫度范圍。

1.3.3 酶制劑最適pH值范圍的確定

配置 pH 值梯度為 3、4、5、6、7 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。按同樣步驟在不同pH值條件下以4種酶制劑的最佳使用酶活力進行酶解試驗，確定4種酶制劑酶解飼用海藻粉最適pH值范圍。

1.3.4 酶制劑最適酶解時間條件的確定

設置酶解時間梯度為 30、60、90、120、150 min。按照同樣步驟在不同酶解時間條件下以4種酶制劑的最佳使用酶活力進行酶解試驗，確定4種酶制劑酶解飼用海藻粉最適酶解時間條件。

1.3.5 4種酶制劑酶解飼用海藻粉的正交試驗

為了考查溫度、pH值、酶解時間等因素間的相互影響以及綜合作用，在確定了4種酶制劑最適酶解溫度范圍、pH值范圍和時間條件后，進行L9(33)正交試驗，以確定4種酶制劑最佳使用條件。

1.3.6 3種非淀粉多糖酶的評價試驗

在獲得了3種非淀粉多糖酶酶解海藻粉中NSPs的最佳使用條件后，為了更好地評價3種非淀粉多糖酶的作用能力，應在其最佳使用條件下同時進行酶解評價試驗。通過對比與評價可以確定3種非淀粉多糖酶對海藻粉的酶解能力與酶解效果。

1.3.7 纖維素酶、木聚糖酶與中溫淀粉酶的復合試驗

海藻粉中的NSPs主要有纖維素、半纖維素、葡聚糖等，其中纖維素和半纖維素主要存在于海藻細胞壁中，而細胞壁的存在阻礙了淀粉酶對細胞壁內淀粉的酶解。為了進一步驗證纖維素酶和木聚糖酶對海藻細胞壁中NSPs的酶解情況，應進行纖維素酶、木聚糖酶與中溫淀粉酶復合酶解試驗，由于β-葡聚糖在細胞壁中量很少，不對其進行復合試驗研究。復合酶解試驗條件為：每克海藻粉中添加復合的各酶活力均為40U，溫度為45℃，pH值為6、酶解時間為60 min。通過復合酶酶解試驗與單一酶酶解的對比試驗來確定細胞內淀粉是否被利用，從而可以進一步證明纖維素酶和木聚糖酶對海藻細胞壁中NSPs的酶解效果。

2 結果與分析

2.1 4種酶制劑酶解海藻粉單因素試驗結果

2.1.1 酶使用量對4種酶制劑酶解效果的影響 (見圖1)

圖1 酶活力對還原糖增加量的影響

由圖1可以看出，每克海藻粉中使用纖維素酶在30 U以上時還原糖的增加量基本不變，說明此時纖維素酶對底物酶解效果達到最佳，結合經濟效益考慮應將30 U作為纖維素酶的最佳使用量。同理，每克海藻粉中木聚糖酶最佳使用量為40 U；每克海藻粉中β－葡聚糖酶的最佳使用量為40 U；每克海藻粉中中溫淀粉酶的最佳使用量為40 U。由于后3種酶制劑的最佳使用量均為40 U，為了在接下來的試驗中增強4種酶制劑的對比，在單因素試驗以及正交試驗和對比復合試驗中每克底物使用4種酶制劑的量均為40 U。

2.1.2 溫度條件對4種酶制劑酶解效果的影響(見圖2)

圖2 溫度對還原糖增加量的影響

由圖2可以看出，纖維素酶在40～50℃之間時對海藻粉的酶解效果最好。同理，木聚糖酶的最適酶解溫度范圍約在35～45℃之間；β－葡聚糖酶最適酶解溫度范圍約在45～55℃之間；中溫淀粉酶的最適酶解溫度范圍在40～50℃之間。

2.1.3 pH值條件對4種酶制劑酶解效果的影響 (見圖3)

圖3 pH值對還原糖增加量的影響

由圖3可以看出，纖維素酶pH值范圍約在4.5～6之間時對海藻粉的酶解效果最好。同理，木聚糖酶的最適酶解pH值范圍在5～6之間；β－葡聚糖酶的最適酶解pH值范圍在5～6.5之間；中溫淀粉酶的最適酶解pH值范圍在5.5～6.5之間。

2.1.4 酶解時間條件對4種酶制劑酶解效果的影響(見圖4)

圖4 酶解時間對還原糖增加量的影響

由圖4可以看出，纖維素酶、木聚糖酶、β－葡聚糖酶、中溫淀粉酶在酶解時間達到60 min后，還原糖增加量基本不再變化。

2.2 4種酶制劑酶解飼用海藻粉的正交試驗結果

通過前面4種酶制劑的單因素試驗確定了其最適溫度范圍、pH值范圍、酶解時間條件，為了考查各個因素之間的綜合效應，分別用溫度、pH值、酶解時間這3個因素對其進行L9(34)正交試驗，正交試驗的因素水平設計見表1(表中的空白因素略去)。各個因素的水平的選擇均在其最適范圍內平均劃分。

表1 4種酶制劑酶解海藻粉正交試驗因素水平設計

4種酶制劑酶解海藻粉的正交試驗結果見表2，數據直觀分析見表3。

表2 4種酶制劑酶解海藻粉正交試驗結果

表3 4種酶制劑酶解海藻粉正交試驗數據直觀分析

由表2可知，對于纖維素酶，由極差分析可知，pH值極差最大，為0.134，其次為溫度，酶解時間影響較小，其最佳組合為B2A1C2，即pH值為5.5、溫度為40℃、酶解時間為60 min時酶解效果最好，為其最佳使用條件；對于木聚糖酶，由極差分析可知，pH值極差也是最大，為0.843，其次為溫度、酶解時間，其最佳組合為B3A3C1，即pH值為6、溫度為45℃、酶解時間為40min時酶解效果最好，為其最佳使用條件；對于β-葡聚糖酶，由極差分析可知，溫度極差最大，為0.624，其次為酶解時間和pH值，其最佳組合為A2C2B3，即溫度為50℃、酶解時間為60 min、pH值為6時酶解效果最好，為其最佳使用條件；對于中溫淀粉酶，由極差分析可知，pH值極差最大，為0.527，其次為酶解時間、溫度，其最佳組合為B2C2A1，即pH值為6、酶解時間為60 min、溫度為45℃時酶解效果最好，為其最佳使用條件。

2.3 評價試驗與復合試驗結果(見圖5)

評價試驗為A、B、C號試驗，同時在3種非淀粉多糖酶的最佳使用條件下進行，由圖5可以看出，β-葡聚糖酶對海藻粉的酶解能力較好，還原糖增加率達到19.0%，纖維素酶和木聚糖酶的酶解能力相近，還原糖增加率均為10%左右，這一點與海藻細胞壁中纖維素與半纖維素含量相近一致。通過評價試驗可以發現：3種非淀粉性多糖酶對飼用海藻粉中的NSPs有一定酶解效果，可使其中的部分NSPs轉化為可被動物吸收的營養物質——還原糖。

復合試驗為 E、F、G號試驗，其中A、B、C、D號試驗為其對比。

圖5 4種酶制劑酶解海藻粉評價與復合試驗結果

由圖5可以看出，E試驗中還原糖增加量與還原糖增加率分別為1.754 mg/g和29.6%，高于A試驗和D試驗中還原糖增加量之和1.261 mg/g及還原糖增加率之和21.3%；F試驗的還原糖增加量與還原糖增加率分別為1.543 mg/g和26.1%，也高于B試驗和D試驗中還原糖增加量之和1.310 mg/g及還原糖增加率之和22.1%。在G試驗中，還原糖增加量與還原糖增加率分別達到3.013 mg/g和50.9%，較A試驗、B試驗和D試驗中的還原糖增加量之和1.954 mg/g及還原糖增加率之和33.0%分別提高了1.059 mg/g和17.9個百分點。這說明，纖維素酶和木聚糖酶對海藻細胞壁進行了較好的酶解，細胞內的淀粉類物質部分被中溫淀粉酶酶解。另外，G試驗中還原糖增加量3.013 mg/g與還原糖增加率50.9%既高于B試驗和E試驗中還原糖增加量之和2.447 mg/g及還原糖增加率之和41.3%，也高于A試驗和F試驗中還原糖增加量之和2.187 mg/g及還原糖增加率之和37.0%，這表明纖維素酶與木聚糖酶共同使用時效果好于其單獨使用。

3 結論

本文以預消化的方法研究了纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶和中溫淀粉酶對飼用海藻粉中NSPs的酶解情況。通過單因素試驗與正交試驗確定了4種酶制劑酶解的最佳使用條件。通過評價試驗發現，3種非淀粉多糖酶在其最佳使用條件下對海藻粉中的NSPs均有較好的酶解效果。通過復合試驗證明纖維素酶和木聚糖可以有效地酶解細胞壁中的NSPs，其中纖維素酶、木聚糖酶和中溫淀粉酶復合試驗比單一酶試驗還原糖增加量之和及還原糖增加率之和分別提高了1.059 mg/g和17.9個百分點。

研究表明：非淀粉多糖酶對飼用海藻粉中的NSPs進行了有效酶解，增加了其營養物質含量，可以提高飼用海藻粉利用率。

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