痘苗病毒轉移載體pSC65－HPV18E6、E7的構建及鑒定＊

王雪蓮，張曉嬌，趙 峰，安春麗

2.盤錦市疾病預防控制中心 ，盤錦 124010；

3.中國醫(yī)科大學實驗動物部，沈陽 110001

研究證實，高危型人乳頭瘤病毒（human papil －lomavirus，HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的首要因素［1－2］。幾乎所有的宮頸癌組織均含有 HPV DNA，其中，HPV16、HPV18是最常見的型別。HPV18高表達的宮頸癌具有浸潤性強、從宮頸非典型增生到浸潤癌進展快、淋巴轉移率高、復發(fā)率高等特點［3］，而目前采用的治療方法，如手術、放療和化療等創(chuàng)傷大，可能剝奪年輕患者的生育功能。

高危型HPV編碼的E6、E7蛋白是宮頸癌發(fā)生的關鍵因子，在HPV誘導腫瘤形成過程中發(fā)揮至關重要的作用［4－6］。二者持續(xù)表達在所有宮頸癌細胞中，是宮頸癌的特異性蛋白，而正常組織及細胞中不存在這兩種蛋白。研究證實，E6、E7蛋白具有免疫原性，誘導機體產生的特異性細胞免疫在清除病毒感染細胞和病毒誘導形成的腫瘤細胞過程中發(fā)揮重要的作用。為了研究HPV18感染者產生的免疫反應及開展HPV18高表達宮頸癌患者的免疫治療，我們構建了包含HPV18E6、E7基因的痘苗病毒轉移載體，為下一步構建重組痘苗病毒及表達相應的蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 HPV18型全基因質粒和pSC65質粒由UAMS微生物與免疫學教研室保存。PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、KpnI/SalⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶、感受態(tài)細菌E.coli DH5α、DNA marker均購自美國Invitrogen公司，HPV18E6、E7引物（儲存濃度25pmol/μL）由美國IDT公司合成，序列如下：

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增HPV18E6、E7片段 以HPV18全基因質粒為模板，PCR擴增HPV18E6、E7基因。PCR體系總體積100μL。體系如下：pHPV18質粒（10ng/μL）1μL，10mmol/L dNTP 1μL，10×Buffer 10μL，E6F/E7F（25pmol/μL）1μL，E6R/E7R（25pmol/μL）1μL，50mmol/L MgCl2（終濃度1.5mmol/L）3μL，Taq 0.5μL（5u/μL）。PCR程序（E6和E7）為94℃變性3min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，共40個循環(huán)，72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.2.2 pSC65－HPV18E6、E7質粒的構建 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，參照凝膠回收試劑盒回收目的片段。將PCR產物與pSC65質粒首先用KpnI酶切，產物純化后用Sal I酶切，再純化后連接。

KpnI酶切體系（總體積20μL）及條件如下：pSC65質粒（0.2μg/μL）5μL，React 4 2μL，KpnI 1μL；HPV18E6/E7 10μL，React 4 2μL，Kpn I 1μL。37℃酶切1h。

Sal I酶切體系（總體積20μL）及條件如下：pSC65質粒（0.2μg/μL）10μL，React 10 2μL，Sal I 1μL；HPV18E6/E7 10μL，React 10 2μL，Sal I 1μL。37℃酶切1h。

連接體系（總體積20μL）及條件如下：HPV18 E6/E7酶切純化產物10μL，pSC65質粒酶切純化產物1μL，5×Ligation Buffer 4μL，連接酶2μL。14℃20h。

1.2.3 重組質粒的轉化、PCR篩選可能的陽性克隆、酶切分析與測序鑒定 連接產物用酚－氯仿－異丙醇純化，轉化感受態(tài)細菌E.coli DH5α。接種于含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取孤立菌落，PCR篩選可能含pSC65－HPV18E6/E7重組質粒的克隆。PCR反應體系構成及反應程序同上，總體積為20μL。PCR陽性克隆提質粒，KpnI/SalⅠ雙酶切鑒定，酶切體系同上。含有340bp、500bp目的片段的克隆送UAMS微生物與免疫學實驗室測序，對測序結果進行BLAST同源性分析。

2 結 果

2.1 PCR擴增HPV18E6、E7片段 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在500bp（HPV18 E6）、340bp（HPV18E7）處出現(xiàn)特異條帶（圖1）。

圖1 PCR擴增HPV18E6、E7片段MDNA marker 1HPV18E6片段 2HPV18E7片段Fig.1 PCR amplification of HPV 18E6/E7fragmentM：DNA marker；1：HPV18E6fragment；2：HPV18E7fragment

2.2 PCR篩選可能的陽性克隆 自HPV18E6、E7兩塊平板中各隨機挑選的9個氨芐青霉素抗性克隆，分別有8，6個克隆在500bp、340bp處出現(xiàn)明顯特異條帶（圖2，3），這些陽性克隆可能是含有pSC65－HPV18E6、E7重組質粒。

圖2 PCR篩選可能含pSC65－HPV18E6的陽性克隆1－8：可能含pSC65－HPV18E6的克隆；9 可能陰性克隆；10PCR擴增產物；MDNA markerFig.2 Selection of clones which might contain recombinant plasmid pSC65－HPV18E6by PCR1－8：Clones which might contain pSC65－HPV18E6；9：Possible negative clone；10：Amplification product of PCR；M：DNA marker

圖3 PCR篩選可能含pSC65－HPV18E7的陽性克隆2，4－8：可能含pSC65－HPV18E7的克隆；1，3，9：陰性克隆；10：PCR擴增產物；MDNA markerFig.3 Selection of clones which might contain recombinant plasmid pSC65－HPV18E7by PCR1－8：Clones which might contain pSC65－HPV18E7；9：Negative clone；10：Amplification product of PCR；M：DNA marker

2.3 pSC65－HPV18E6、E7的酶切鑒定與測序分析 以KpnI/SalⅠ雙酶切對可能的陽性克隆進行鑒定，結果見圖4，5。圖4為pSC65－HPV18E6經雙酶切，泳道2，3為可切出約500bp的目的片段和7 000bp的載體片段，與預期一致；圖5泳道1－6為pSC65－HPV18E7經雙酶切，可切出分別約為340bp的目的片段和7 000bp的載體片段，與預期一致；故可初步鑒定該質粒為陽性克隆質粒。

上述酶切鑒定正確的陽性質粒測序結果顯示該質粒中的目的片段與預期完全一致（圖6，7），證明該質粒為所需陽性克隆質粒。

3 討 論

痘苗病毒具有宿主范圍廣，對分裂和非分裂細胞均有感染性，可容納大片段外源基因插入，能正確合成、加工和翻譯外源蛋白等優(yōu)點，因而被廣泛應用于疫苗研究。痘苗病毒由于其酶切位點多且復雜，外源基因不能直接插入，需要利用帶有野生型痘苗病毒DNA序列的質粒作為轉移載體，將攜帶外源基因的重組質粒轉染野生型痘苗病毒感染的細胞，二者在細胞內發(fā)生同源重組［7－8］，進而獲得重組的痘苗病毒。

pSC65質粒具有野生型痘苗病毒DNA序列，可用作轉移外源基因至痘苗病毒的載體。本研究將HPV18E6、E7基因插入，獲得重組轉移載體pSC65－HPV18E6、E7，為進一步構建含 HPV18 E6、E7基因的重組痘苗病毒，獲得相應的蛋白，研究HPV18感染者的免疫反應奠定基礎。

圖4 重組質粒pSC65－HPV18E6酶切鑒定2，3陽性克隆 1，4－11陰性克隆 MDNA MarkerFig.4 Identification of recombinant plasmid pSC65－HPV18 E6/E7by restriction enzyme digestion2，3：Positive clones；1，4－11：Negative clones；M：DNA marker

圖5 重組質粒pSC65－HPV18E7酶切鑒定1－6陽性克隆 7－8陰性克隆 MDNA MarkerFig.5 Identification of recombinant plasmid pSC65－HPV18 E7by restriction enzyme digestion1－6：Positive clones；7－8：Negative clones； M：DNA marker

圖6 pSC65－HPV18E6測序結果Fig.6 Sequencing of plasmid pSC65－HPV18E6

圖7 pSC65－HPV18E7測序結果Fig.7 Sequencing of plasmid pSC65－HPV18E7

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