HPLC測定復方菊陳顆粒中綠原酸的含量

黃 媚 劉喜華

1黃媚（1979.8—），女，助理工程師，主要從事制劑開發和檢驗工作，廣西梧州制藥集團（股份）有限公司 廣西梧州 543002 2 廣西衛生職業技術學院 廣西南寧 543002

復方菊陳顆粒是由菊花等多味中藥組成的復方制劑，具有散風清熱、燥濕健脾等功效，可用于風熱感冒、厭食口膩等癥狀，臨床上還將其用于解酒、醒酒等方面。本實驗以菊花中的綠原酸為控制指標，采用高效液相色譜法（HPLC）對成品進行質量控制。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Ultimate XB-C18（月旭材料科技（上海）有限公司，4.6×250mm，5μm）；BS224S電子天平（北京賽多利斯）；LG-16WA臺式高速離心儀（北京京立離心機有限公司）；SB5200DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品，供含量測定用，購于中國藥品生物制品檢定所，批號為：110753-200413；甲醇、乙腈（美國fisher公司，色譜醇）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其它試劑為分析純；復方菊陳顆粒三批（本公司自行研制，批號：110901、110902、110903）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

結合預試驗結果，按以下條件和方法進行。色 譜 柱：Ultimate C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫（詳見表1）；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：328nm；柱溫：300；進樣量：10μL；理論塔板數計算應不少于7500[1-3]。分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液按照上述色譜條件進行測定。結果表明：供試品溶液中綠原酸能與相鄰組分峰分離，分離度R＞1.5，陰性對照品溶液無干擾，色譜圖見圖1-3。

表1 綠原酸含測梯度洗脫程序（后運行時間：10min）

圖1 綠原酸對照品色譜圖（a為綠原酸）

圖2 供試品色譜圖（a為綠原酸）

圖3 陰性樣品色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取低溫真空干燥至恒重的綠原酸對照品適量，加甲醇至溶解制成每1ml中含33.04μg綠原酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品研細1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20ml，稱定重量，超聲提取60min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45μm微孔濾膜即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

按處方比例配制成不含菊花的陰性樣品，并按2.2.2項下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 線性關系考察

精密稱取綠原酸對照品4.13mg置于25m1容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，制成濃度為165.2μg/ml的綠原酸對照品溶液，然后分別稀釋成 82.6、33.04、16.52、6.608μg/ml。按上述色譜條件，分別吸取這5個對照品溶液10μl進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，并計算得回歸方程為Y=23.818X-63.398，r=0.9998。結果表明，綠原酸在進樣量為0.066μg～1.652μg線性良好。

2.4 精密度試驗

精密吸取濃度為33.04μg/ml的綠原酸對照品溶液10μ1，按上述色譜條件重復進樣6次，測定綠原酸峰面積，RSD值僅為0.39%，表明儀器的精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在制備后0，2，4，6，8，10，12h精密吸取10μl進樣，記錄每次進樣綠原酸峰面積，RSD值為2.06%，表明供試品溶液在12h內穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品（110901）6份，按供試品溶液的制備方法制備，進樣10μl，測定峰面積。計算綠原酸含量。綠原酸平均含量為0.3820mg·g-1，RSD值為2.29%，表明該方法的重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已測得綠原酸含量的樣品(110901)6份，每份1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的綠原酸對照品，按2.2.2項下的方法制備供試品，在上述色譜條件下依法測定，計算回收率，結果見表2。

表2 綠原酸加樣回收試驗結果

2.8 樣品測定

取三批樣品研細，取1g，精密稱定，按2.2.2項下的方法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10μ1，注入液相色圖譜儀，測定綠原酸峰面積，外標法計算綠原酸的含量，結果見表3。表中RSD值為0.04%，表明三批樣品綠原酸含量穩定。

表3 樣品綠原酸含量測定

3 討論

3.1 預實驗曾對綠原酸采用了高效液相的等度洗脫，但在連續注入數個樣品之后，后期色譜圖基線出現了極大的波動，可能為低極性物質保留時間過長導致，于是將綠原酸的測定改為梯度洗脫，使低極性物質不影響綠原酸的測定，同時節省分析時間。

3.2 供試品中的綠原酸進行DAD掃描，結果發現在328nm處有最大吸收，故確定其作為檢測波長。同時對供試品制備方法進行了提取溶劑、提取方法、提取時間的考察，結果表明：甲醇提取的綠原酸比水及乙醇提取的更充分；超聲提取比回流提取及索氏提取的更完全；30min、60min、90min提取以60min提取的含量最高，故供試品制備方法按上述最佳條件進行。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：化學工業出版社，2010:292.

[2]陳秋虹，徐慧，蔣艷芳.高效液相色譜法測定桑葉中的綠原酸和蘆丁的含量[J].中華中醫藥雜志，2009,(5):663-665.

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