大鼠坐骨神經移植后脊髓相應節段運動神經元中P-Erk1/2的表達和變化

朱春雷 呂樹振 趙世偉

當周圍神經損傷后，脊髓前角運動神經元胞體都會發生損傷性反應，都有一定數量的神經元胞體死亡，神經元胞體的變化在再生調控中起重要的作用，而神經元胞體內的變化是錯中復雜的，研究周圍神經損傷后神經元凋亡途徑的激活等對抑制神經元的凋亡、加強神經元胞體的保護和促進神經損傷后的功能恢復有重要意義。胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一員，它的信號傳遞途徑涉及調節細胞生長、發育及分裂，是信號網絡核心，ERK1/2通過細胞分裂周期影響增殖與分化，對細胞凋亡的抑制、創傷愈合、神經的再生起重要作用[1]。目前對坐骨神經切斷后P-Erk-1/2的表達變化，尚未見報道。本實驗通過對大鼠坐骨神經切斷術后在不同時相P-ERK1/2表達的檢測，為神經細胞凋亡的調控研究提供可靠的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物 吉林大學動物實驗室購置10W～12W成年Wister大鼠（約250克）共80只，并隨機分為假手術組（A組）和坐骨神經切斷組（B組），每組40只；

主要試劑：一抗P-ERK1/2-1（Promega公司）、β-actin（Sigma公司）、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒( Santa Cruz 公司)，使用濃度及方法嚴格按照說明書配置。

1.2 模型制備與取材 3%戊巴比妥鈉40 mg／kg腹腔麻醉大鼠后常規消毒，做右側臀部斜切口,鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經。假手術組中的動物模型暴露坐骨神經后逐層縫合皮膚；將坐骨神經切斷組中的動物模型的坐骨神經完全切斷,在12倍手術顯微鏡下將其神經兩端正確對位后，用9-0無損傷線吻合斷端4～6針，并逐層縫合皮膚。

取材：將每組5只大鼠，經3%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，待生效后常規消毒，切取L4～L6段脊髓右側標記好后浸置于液氮中備有。

1.3 western- blot方法 快速將液氮中的組織取出，分離提取蛋白，測定濃度，每泳道15ug總蛋白進行10% SDS－PAGE電泳，轉至PDVF膜，一抗p-Erk1/2抗體(1:2,500)，4℃搖床輕搖孵育過夜，二抗Goat Anti Rabbit IgG, FITC偶聯抗體（1：5000）室溫搖床輕搖2h；按ECL 顯色試劑盒說明書操作顯色，X 光膠片曝光，然后進行條帶掃描和分析P-ERK1/2表達。

1.4 統計學方法 將western-blot條帶掃描和分析，各組數據以±s表示，采用SPSS10.0版軟件進行統計分析，組間t檢驗比較，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

P-Erk1/2隨時相的改變在脊髓中表達情況 通過應用western-blot方法對大鼠坐骨神經切斷后相應脊髓階段中PErk1/2表達的檢測發現，P-Erk1/2在L4～L6在脊髓中的表達隨時間的變化而改變，如圖2所示，在假手術組中脊髓前角運動神經元中的P-ERK1/2僅有少量表達并維持一定的水平；坐骨神經切斷組在坐骨神經切斷后1W內P-ERK1/2表達增加、2W達高峰、8W恢復正常水平。各組間數據分析在1W～4W組中PErk1/2表達坐骨神經切斷組明顯高于假手術組（P<0.05）具有統計學意義。見圖1、圖2。

圖1 大鼠坐骨神經切斷后P-Erk1/2在脊髓中的表達Fig1.Expression of phospho-Erk1/2 in rat spinal cord after sciatic nerve transaction

圖2 大鼠坐骨神經切斷后P-Erk1/2在脊髓中的分析

3 討論

有關神經損傷后胞體反應性的變化的研究結果認為，神經損傷后胞體的變化主要與神經元的類型、生物體的年齡、損傷部位到胞體的距離、軸突延伸的環境、神經元的興奮性及損傷類型有關[1]，而這些因素又與神經損傷后的再生特性密切關聯，在周圍神經損傷與再生過程中神經元胞體內在自身修復的過程中發生一系列的變化，同時存在細胞間的微環境變化及信號的產生與傳導。

本實驗通過應用western-blot方法分析、比較假手術組與坐骨神經切斷組在不同時相P-Erk1/2蛋白量的表達變化，從實驗結果中看到在假手術組中也存在著P-ERK1/2的表達，但表達的量較低，而且不隨時間的變化而發生改變，說明了手術并不會對相應節段脊髓P-Erk1/2蛋白量的表達產生影響，在坐骨神經切斷組中1W時已經呈陽性表達，在2W時達到高峰后逐漸下調，至8W時其表達接近假手術組水平，由此可見P-ERK1/2的表達具有時間依賴性，同時我們也注意到假手術組和坐骨神經切斷組在各時相的表達存在差異：在術后1W時坐骨神經切斷組中P-ERK1/2表達明顯高于假手術組，說明坐骨神經切斷后帶來的刺激在1W內就激活了MAPK /ERK1/2信號通路，活化后的ERK(p-ERK)轉位至細胞核內對轉錄因子磷酸化而調節轉錄活性，這樣它就起到一個承上啟下的作用，將胞外信號傳導到核內[2]。被激活的ERK將特定的底物磷酸化，如磷脂酶、轉錄因子和細胞結構蛋白等，通過這一途徑，被激活的蛋白質發揮一系列生理作用，如基因表達、有絲分裂、增生、移動和新陳代謝等[3]。P-ERK1/2再將其他各種各樣的底物，包括細胞膜蛋白、核蛋白、轉錄因子以及幾種MAPK激活蛋白激酶（MKs）等磷酸化促使神經元胞體合成神經再生所需要的各類蛋白增加，促進神經元軸突的再生；而且P-ERK1/2能抑制caspase-9的活性，進而抑制caspase-3，從而抑制凋亡[4]，推測坐骨神經切斷1W時在各種因素的刺激下促進軸突生長以及相關促進生長的蛋白及因子的合成加快，并且降低了神經元凋亡的發生；而在假手術組中并未發生明顯的變化，表明在未切斷坐骨神經的手術過程中，并不會激活MAPK/ERK kinase途徑。在坐骨神經切斷術后2W 時P-ERK1/2 的表達達到了高峰，表明P-ERK1/2在各種因素的刺激下，持續激活MAPK/ERK途徑并發揮作用，在此時期可能是有絲分裂加速最快、蛋白合成最多、軸突生長最快的時期；PERK1/2表達逐漸下調，表明基因表達、有絲分裂、增生、移動和新陳代謝包括細胞膜蛋白、核蛋白、轉錄因子等下調或降低[5]。

通過本實驗的結果可以推斷在坐骨神經切斷術后4～8W時神經元的再生能力會逐漸降低。各組間數據分析在1W～4W組中P-Erk1/2表達坐骨神經切斷組明顯高于假手術組（P<0.05）具有統計學意義，其兩組中各時相表達結果與免疫組化的實驗結果基本一致，實驗結果可靠。說明坐骨神經切斷后，MAPK/ERK1/2信號途徑在1W內就已經被激活而發揮調控作用。

神經損傷后，再生信號立刻啟動，雖然調控細胞凋亡的激活和抑制機制還未闡明，但通過本實驗證明了周圍神經損傷后確實出現P-ERK上調，進而發揮抗凋亡促進軸突再生的作用。因此如果能研究出一種能持續調控MAPK/ERK1/2信號通路的方法,將有利于加強神經元胞體的保護,促進神經損傷后的功能恢復，在臨床應用中具有重要意義[6]。

[1]Vicki Waetziga, Thomas Herdegen.The concerted signaling of ERK1/2 and JNKs is essential for PC12 cell neuritogenesis and converges at the level of target proteins[J].Molecular and Cellular Neuroscience,2003, 21(1):238-249.

[2]Colucci-D, Amato L, Perrone-Capano C, et al.Chronic activation of ERK and neurodegenerative diseases[J].Bioessays,2003,25(11):1085-1095.

[3]Philippe P，Roux and John Blenis，ERK and p38 MAPK-Activated Protein Kinases: a Family of Protein Kinases with Divers e Biological Functions[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2004,68(2).320-344.

[4]Allan L.A., Morrice N., Brady S., et al.Inhibition of caspase-9 through phosphorylation at Thr 125 by ERK MAPK[J].Nat.Cell.Biol 2003, 5(7):647-654.

[5]Michaela Moors, Jason E.Cline, Josef Abe, et al.ERK-dependent and -independent pathways trigger human neural progenitor cell migration[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2007, 221(1):57-67.

[6]朱春雷,吳廣志,徐明珠,等.大鼠坐骨神經切斷術后在背根神經節中P-Erk1/2表達和變化[J].中國實驗診斷學,2009,13（3）：345-347.