谷氨酰胺對心肌細(xì)胞線粒體膜PTP開放干預(yù)作用的實驗研究＊

劉鐵民,張玉玲

(1.聊城大學(xué)體育學(xué)院生化室,2.聊城大學(xué)醫(yī)院,山東聊城 252059)

線粒體是心肌細(xì)胞損傷時的主要受損部位[1],線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore,PTP)為位于線粒體內(nèi)外膜間的多蛋白孔道,是線粒體內(nèi)外信息交流的中心樞紐[2]。PTP開放是導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移和凋亡蛋白釋放、調(diào)控細(xì)胞死亡的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[3]。研究表明[4],過度訓(xùn)練可導(dǎo)致線粒體膜PTP的開放,過度訓(xùn)練狀態(tài)下心肌線粒體鈣代謝的紊亂、自由基生成增加、磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)活性增加等變化皆與PTP開放密切相關(guān)。但如何遏制或調(diào)節(jié)PTP開放,能否通過外源性物質(zhì)的補充來調(diào)節(jié)PTP的開放,這些問題尚不清楚。本研究通過補充外源性谷氨酰胺(glutamine,G ln)的對比試驗,探討G ln對心肌細(xì)胞線粒體膜PTP開放的干預(yù)作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

羅丹明 123(Rhodamine123,Rh123)、魚藤酮(Rotenone)、寡霉素(Oligomycin)、魯米諾 (Luminol)(Sigma),SDS(Pharmacia),Tris、TEMED(AMRESCO),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。U-2001紫外分光光度儀(HITACHI),F-4500熒光分光光度儀(HITACHI),3K18低溫高速離心機(Sigma)。

1.2 實驗動物

30只健康雄性SD大鼠(180～220g)(中國科學(xué)院動物研究所提供),隨機分為對照組(CG組)、過度訓(xùn)練組(OG組)和補充 G ln+過度訓(xùn)練組(G OG組)(n=10)。分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃±3℃,相對溫度60%±15%,自然光照,自由飲食和飲水。G OG組大鼠訓(xùn)練開始,每天早晨8點每只大鼠灌服G ln溶液1次(G ln溶液濃度為10%,灌服劑量為500mg/kg bw),連續(xù)灌服8周;為排除灌胃對大鼠刺激的影響,CG組、OG組每天灌服等量的生理鹽水1次。

1.3 實驗方法

1.3.1 過度訓(xùn)練動物模型的建立 CG組動物進(jìn)行中等強度的跑臺(BCPT-96型)訓(xùn)練。第1周:每天完成10m/min×10min的跑臺運動;第2周:每天完成10m/min×10min的跑臺運動后,繼續(xù)加速至15 m/min×10min;以后維持這一運動量直至第8周周末。每周訓(xùn)練5 d,周末休息。OG組與 G OG組動物進(jìn)行持續(xù)大運動量跑臺(BCPT-96型)訓(xùn)練8周,包括一般訓(xùn)練和力竭訓(xùn)練各4周。動物跑臺坡度為10°,每周訓(xùn)練5天,周末休息。一般訓(xùn)練:第1周:每天完成10m/min×10min的跑臺運動;第2周:每天完成10m/min×10min跑后,繼續(xù)加速至15 m/min ×10min;第 3 周:每天進(jìn)行 10m/min、15 m/min、20m/min各10min的持續(xù)跑臺訓(xùn)練;第4周:每天分別進(jìn)行 10m/min、15 m/min、20m/min、25 m/min各10min的持續(xù)運動。力竭性訓(xùn)練:從第5周起進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺運動,每天以15 m/min、20m/min、25 m/min各10min運動后加速至30m/min、35 m/min各20min運動,并不斷遞增跑速,直至大鼠力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn):連續(xù)予大鼠施加聲、光、機械刺激后,大鼠不能跑動,下跑臺后連續(xù)喘息,暫時無逃避反應(yīng)。第6、7、8周做與此相同的訓(xùn)練。訓(xùn)練中動態(tài)觀察大鼠的精神狀態(tài)和飲食情況,從第5周開始,每天記錄動物的跑距(m),每周末稱量所有參試動物體重。第8周周末,運動后即刻斷頭處死全部動物。

1.3.2 大鼠心肌線粒體的制備 大鼠斷頭處死后,立即取心臟,剪取心室肌,置于預(yù)冷的分離介質(zhì)中(0.125 mol/L sucrose、0.101 mol/L Tris-HCL,pH 7.4),洗去血液,充分剪碎、勻漿,采用差速離心法分離線粒體,即首先以700×g離心7 min,棄沉淀,上清經(jīng)10000×g離心10min,棄上清,用分離介質(zhì)懸浮沉淀,以同樣高速離心1次,沉淀以分離介質(zhì)懸浮即制成線粒體懸液,以上操作均在0℃～4℃進(jìn)行。極譜式氧電極法測定線粒體耗氧速率以確定其純度。蛋白定量采用Bradford法,線粒體用量根據(jù)其蛋白含量決定。

1.3.3 線粒體PTP開放的檢測 (1)紫外分光光度儀檢測參照Sarah等[5]的方法,用分光光度儀檢測在540nm處的線粒體吸光度(A540nm)的變化來測定PTP開放。反應(yīng)體系:0.12 mol/L surose,10mmol/L Tris-Mops,pH 7.4,5 mmol/L succinate-Tris,1 mmol/L Pi-Tris,10μmol/LEGTA-Tris,2μmol/L rotenone,1 mg/L oligomycin;線粒體用量為0.15 g/L蛋白濃度;反應(yīng)溫度為25℃恒溫;終體積為2 ml。反應(yīng)開始,加入線粒體,記錄其在540nm處的初始吸光度值(A0),1 min后加入150μmol/L CaCl2,記錄其在15 min內(nèi)吸光度的變化(△A)。△A值的升高或下降分別代表PTP開放程度的降低和增加。(2)熒光分光光度儀檢測參照 Fontaine等[6]的方法,用熒光分光光度儀檢測線粒體膜電位改變來測定PTP開放,反應(yīng)體系同上。取 1 mg線粒體,用 0.12μmol/L Rh123培育5 min后,在F-4500熒光分光光度儀上立即檢測體系中Rh123的熒光強度(激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm),記錄為 F 0、1 min后再加入150μmol/L CaCl2,記錄其在15 min內(nèi)熒光強度的變化(△F)。△F值的升高或降低,分別表示PTP開放程度的下降和增加。

1.3.4 心肌線粒體谷胱苷肽(glutathione,GSH)含量的測定采用電化學(xué)法,鈷酞箐(COPC)修飾電極及高壓液相色譜聯(lián)用[7]。

1.3.5 心肌線粒體膜磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)活性測定參考文獻(xiàn)[8],用高靈敏度pH計(PX-215型)離子活度計測定消耗鹽酸的量來計算PLA2的活力。

1.3.6 線粒體丙二醛(malondialdehyde,MDA)的測定采用硫代巴比妥酸縮合法,試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,方差分析比較組間顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 心肌線粒體PTP開放的變化

OG組與G OG組相比,線粒體在540nm處的初始吸光度值(A0)顯著下降(P<0.05)。線粒體在15 min內(nèi)的吸光度變化(△A)與 G OG組比較,OG組顯著降低(P<0.05)。OG組線粒體Rh123的初始熒光強度(F0)與 G OG組比較,顯著增強(P<0.05)。加入150μmol/L CaCl2后,OG組 △F值與 G OG組比較,明顯降低(P<0.05)。G OG組與CG組比較,無顯著差異(表1)。

Tab.1 Changes of the opening of PTP in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

Tab.1 Changes of the opening of PTP in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

A:Absorbance;F:Fluorescence;PTP:Permiability transition pore＊P<0.05vsG OGgroup

Group A0 △A F0 △F C G 108±45 52.40±0.31 361.67±75.38 174.51±46.34 G OG 114±48 51.32±0.26 371.70±75.26 163.44±48.11 O G 65±31＊ 20.89±0.18＊ 535.32±104.80＊ 89.28±29.75＊

2.2 心肌線粒體MDA、GSH含量和PLA2的活性

與G OG組比較,OG組MDA含量明顯升高(P<0.05),線粒體 GSH含量下降,PLA2活性顯著增加(P<0.05)。G OG組與CG組比較,無顯著差異(表2)

Tab.2 Changes of the MDA and GSH contents and PLA2activity in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

Tab.2 Changes of the MDA and GSH contents and PLA2activity in myocardial mitochondrial membrane(,n=10)

MDA:Malondialdehyde;GSH:G lutathione;FLA2:Phospholipase A2＊P<0.05vsG OGgroup

3 討論

谷氨酰胺(glutamine,G ln)是血液中和體內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的游離氨基酸,具有維持體內(nèi)酸堿平衡、保持小腸黏膜上皮的結(jié)構(gòu)和功能、維持組織中抗氧化劑的貯備、增強免疫功能等重要作用。同時,G ln又是組織間作為氨前體的穿梭工具,是蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)劑及腎臟產(chǎn)氨的重要物質(zhì)。另外,G ln是一個生糖氨基酸,可以提供碳鏈氧化分解釋放能量。G ln作為體內(nèi)含量非常豐富的一種氨基酸,尚具有許多重要的生理功能,它能促進(jìn)胃腸粘膜細(xì)胞增生,維持腸道的完整性,而巨噬細(xì)胞的吞噬作用、淋巴細(xì)胞的增殖以及蛋白質(zhì)的合成作用,都必需依賴充足的G ln。機體在運動過程中體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基,對膜性結(jié)構(gòu)造成損傷,影響運動能力。谷胱甘肽(glutathione,GSH)是體內(nèi)的重要保護(hù)因子,可以保護(hù)巰基酶的活性,可以在谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)催化下,保護(hù)生物膜及生物大分子免受氧化損傷。而 G ln可增加 GSH合成而保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基的損害。增加G ln不但能增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,更重要的能增加細(xì)胞的GSH含量,減少氧自由基對機體膜性結(jié)構(gòu)的損害。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore,PTP)是位于線粒體內(nèi)外膜間由多個蛋白組成的復(fù)合孔道,目前認(rèn)為該復(fù)合體至少由胞漿的己糖激酶、外膜的外周苯二氮卓受體、電壓依賴性陰離子通道等組成[2]。正常情況下,PTP可逆性的低水平開放可維持線粒體跨膜電位,其作用是傳遞電信號和鈣信號,一旦在多種死亡信號的刺激下,PTP發(fā)生大量持續(xù)開放,則引起線粒體內(nèi)膜通透性急劇增加,使得一些正常不能通過內(nèi)膜的物質(zhì)(分子量<1500D)可以自由透過內(nèi)膜,從而繼發(fā)線粒體膜去極化、氧自由基(oxygen free radical,OFR)過量生成、基質(zhì)滲透性腫脹及凋亡效應(yīng)蛋白釋放等一系列細(xì)胞學(xué)效應(yīng),致使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3]。

有關(guān)PTP開放的檢測,目前在整體水平采用較多的是分光光度法,通過測定PTP開放所引起的線粒體狀態(tài)的變化來反映PTP的開放。為保證測定結(jié)果的可靠性,本研究根據(jù)PTP開放的兩個特征性改變-線粒體膜腫脹與膜電位下降,線粒體腫脹可表現(xiàn)為A540nm值下降,利用紫外和熒光分光光度法兩種方法分別檢測了過度訓(xùn)練對大鼠心肌線粒體PTP開放的影響。研究結(jié)果顯示,OG組與CG組和G OG組比較,線粒體在540nm處的初始吸光度值(A0)顯著下降(P<0.05),表明過度訓(xùn)練可導(dǎo)致線粒體PTP開放增加,而 G ln對這種變化有明顯干預(yù)作用。Ca2+為一種常用的 PTP開放誘導(dǎo)劑,Ca2+誘導(dǎo)后PTP的變化能力反映了線粒體PTP的初始狀態(tài);將心肌細(xì)胞線粒體直接置于Ca2+濃度高達(dá)150μmol/L的體系中,發(fā)現(xiàn)線粒體在15 min內(nèi)的吸光度變化(△A)與CG組和 G OG組比較,OG組顯著降低(P<0.01)。PTP開放還可導(dǎo)致線粒體膜電位下降甚至消失。Rh123為正電性熒光染料,正常情況下,線粒體存在內(nèi)負(fù)外正膜電位,Rh123積聚于線粒體內(nèi),當(dāng)PTP開放引起線粒體膜電位消失,儲積在線粒體內(nèi)的Rh123釋放出來,造成線粒體內(nèi)熒光強度降低,而測試介質(zhì)內(nèi)熒光強度增高。結(jié)果顯示OG組線粒體Rh123的初始熒光強度(F0)與CG組和 G OG組比較,顯著增強(P<0.05);加入150μmol/L CaCl2后,OG組△F值與CG組和 G OG組比較,明顯降低(P<0.05)。這些結(jié)果皆表明過度訓(xùn)練可導(dǎo)致線粒體PTP開放增加,而補充外源性的 G ln對PTP開放有顯著的干預(yù)作用。

為探討PTP開放和G ln干預(yù)作用的可能機制,本研究還觀察了運動后心肌線粒體丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH和磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)等生化指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示,運動后OG組與 G OG組和CG組比較,線粒體 GSH含量顯著降低(P<0.05),PLA2活性顯著增加(P<0.05);MDA含量顯著升高(P<0.05)。過度訓(xùn)練后MDA含量明顯增加,表明訓(xùn)練后心肌線粒體氧自由基生成和脂質(zhì)過氧化水平增加了,因為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量變化可作為評定自由基生成及膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞的指標(biāo)。由此看來,過度訓(xùn)練后線粒體氧自由基生成增加可能是誘導(dǎo)PTP開放的重要因素之一,因為內(nèi)源性自由基的存在可以攻擊膜蛋白巰基,致使膜蛋白發(fā)生交聯(lián),導(dǎo)致線粒體膜PTP開放增加[4]。GSH作為細(xì)胞中最豐富的非蛋白巰基的來源,維持線粒體內(nèi)膜巰基基團(tuán)的還原狀態(tài),線粒體 GSH的含量對線粒體膜PTP開放起著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)線粒體 GSH含量處在較高水平時,線粒體PTP處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)線粒體 GSH含量排空時、線粒體內(nèi)膜PTP開放增加[7]。巰基氧化作用對增加PTP開放是必需的,但不是唯一的,過度訓(xùn)練后心肌線粒體活性氧生成增加,活性氧及其脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物MDA也可直接增加PLA2的活性,而PLA2的激活可使PTP開放增加。這是因為PLA2活性增加,可導(dǎo)致膜磷脂的降解加快,其降級產(chǎn)物溶血磷脂、白三烯、前列腺素可促進(jìn)細(xì)胞膜及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解,增加膜的剛性和對鈣的通透性。本研究結(jié)果顯示,過度訓(xùn)練后大鼠心肌線粒體GSH含量顯著下降和PLA2的活性明顯增加,這可能是導(dǎo)致過度訓(xùn)練后心肌線粒體膜PTP開放增加的又一誘發(fā)因素。而G ln作為體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸[9],對細(xì)胞膜的穩(wěn)定性具有廣泛的保護(hù)作用,它可通過增加GSH合成速度而增加細(xì)胞GSH的儲量,這對保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基的損害,遏制PLA2活性增加和Ca2+積聚等方面具有重要意義。總之,關(guān)于PTP開放機制的問題是一個相當(dāng)復(fù)雜的問題,很多問題尚未完全闡明,尚需進(jìn)一步研究。

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