內毒素移位在腸淋巴再灌注加劇SMAO休克大鼠多器官損傷中的作用*

楊麗娜,趙自剛,趙永泉,劉爭杰,牛春雨,張 靜

(河北北方學院微循環研究所,基礎醫學院病理生理學教研室,張家口 075000)

研究表明,腸源性細菌內毒素經腸淋巴途徑移位至全身是二次打擊、失血性休克導致器官損傷的重要機制[1,2],腸淋巴液是危重病發展的橋梁[3,4]。我室以“腸缺血/再灌注”概念為基礎,把“夾閉腸系膜淋巴管(mesenteric lymph duct,MLD)阻斷淋巴液回流1 h,再行淋巴液灌注”稱為“腸淋巴再灌注”(mesenteric lymph reperfusion,MLR);發現單純的MLR對機體不造成損害,但可加劇腸系膜上動脈閉塞性(superior mesenteric artery occlusion,SMAO)休克這一病理過程,降低SMAO休克大鼠的平均動脈壓及24 h存活率,引起遠隔多器官功能障礙及組織學損傷[5],其機制與MLR加重多個器官的自由基損傷、一氧化氮釋放、組織細胞膜泵功能障礙有關[6]。鑒于腸淋巴途徑作為腸源性內毒素移位的關鍵途徑[7],MLR加劇SMAO休克多器官損傷的作用機制是否與內毒素經腸淋巴途徑的移位有關值得研究。為此,本文觀察MLR對SMAO休克大鼠多器官內毒素(endotoxin,ET)、內毒素增敏系統、炎癥介質的影響,揭示腸源性內毒素移位在MLR加劇SMAO休克多器官損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級Wistar雄性大鼠24只,體重280～330 g,購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心(實驗動物許可證號SCXK[軍]2007-004)。隨機分為4組(n=6):假手術組(Sham)、MLR組 、SMAO 組和 SMAO+MLR組。所有大鼠實驗前禁食12h,自由飲水。實驗過程中,動物的處置方法符合動物倫理學標準。

1.2 實驗方法

肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg bw)麻醉大鼠后,剪毛備皮,鋪消毒巾,右股部手術,股動脈插管連壓力換能器接生物信號采集處理系統動態監測平均動脈血壓,股靜脈給予肝素鈉溶液(1 ml/kg bw,即500 U/kg bw)全身抗凝;行腹部手術,暴露腸系膜根部,游離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA),仔細分離與SMA相伴行的腸系膜淋巴管(mesenteric lymphatic duct,MLD)。在血壓穩定10 min后,以無創血管夾,夾閉MLD根部1 h、松開再灌注2 h為MLR組;夾閉SMA根部1 h、松開再灌注2 h為SMAO組;同時夾閉SMA與MLD1 h、松開再灌注2 h為SMAO+MLR組;僅分離SMA、MLD,不夾閉者為Sham組。

1.3 取材與標本制備

所有動物在完成再灌注2 h后(Sham組在相當時間點),立即行腹主動脈無菌取血,置于無熱源的肝素抗凝管中,3500 r/min,離心15min,取血漿封存于無熱源玻璃管中,-80℃下冷凍保存。取血后迅速選擇固定位置,無菌留取肝、腎、肺、心等臟器 0.3～0.5 g組織均分兩份,一份加9倍的無熱源水,用無熱源玻璃勻漿器低溫制備組織勻漿,封存于無熱源玻璃管中,-80℃低溫冰箱(美國熱電)冷凍保存,用于檢測內毒素含量;另一份加5倍的冷生理鹽水,用高速分散勻質機制備組織勻漿(濃度為16.7%),封存于 EP管中,-80℃下冷凍保存,待測CD14、LBP、TNF-α含量。

1.4 內毒素檢測(TAL動態濁度法)

制作標準曲線:將內毒素標準品(中國藥品生物制品檢定所)用檢測用水稀釋至終濃度為2、0.25、0.03125 EU/ml的等比系列標準溶液,分別加入已復溶的鱟試劑(TAL)反應管中,設置陰性對照管與平行管,放入已預熱至37℃的內毒素檢測儀(ATi 320-06,英國伯萊金耐特有限公司)的反應孔內,檢測波長405 nm,預設限值 92%,得到回歸方程 LgT=2.8369-0.2402LgC(T為反應時間,C為溶液中細菌內毒素濃度),r=-0.9837,陰性對照的反應時間＞3 600 s大于最低濃度的反應時間1664.5 s(圖1)。將待測樣本70℃水浴10 min,3 000 r/min離心10 min取上清。首先,檢測不同標本從原液到最大有效稀釋倍數的ET含量,根據ET回收率,確定各標本的最佳有效稀釋倍數為80倍。其次,根據稀釋倍數,設標本陽性對照管(加入0.25 EU/ml的內毒素標準液)與平行管,應用內毒素檢測儀自動采集數據及分析,依據標準曲線,計算ET含量。整個實驗在生物安全柜(美國熱電)中進行無熱源操作,所有與實驗相關的材料或器具,均去熱源。

Fig.1 Standard curve of endotoxin(ET)

1.5 各器官組織勻漿 LBP、CD14、TNF-α檢測

酶聯免疫(ELISA)方法測定各器官組織勻漿中LBP、CD14、TNFα含量(試劑盒由美國R&D公司生產、江蘇希望生物科技有限公司代理),嚴格按照試劑盒說明書操作流程進行標準曲線制備、樣本測定;終止反應后,將酶標板放入酶標儀(Stat Fax-2100型,美國STAT-FAX公司)槽內,選擇450 nm光波長檢測其OD值,繪制標準曲線后,計算各樣本結果。組織勻漿蛋白定量采用考馬斯亮蘭法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 MLR對SMAO休克大鼠血漿內毒素含量的影響

MLR組血漿ET含量(0.124±0.022 EU/ml)與Sham組(0.115±0.022 EU/ml)比較無顯著性差異(P＞0.05);與Sham組和MLR組比較,SMAO組(0.317±0.032 EU/ml)及SMAO+MLR組(0.418±0.066 EU/ml)的血漿ET含量均顯著增高(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR組ET水平高于SMAO組(P＜0.05,圖2)。

2.2 MLR對SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ET含量的影響

MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的ET含量與Sham組比較均無顯著性差異(P＞0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 ET含量均顯著高于Sham組和MLR組(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿ET水平高于SMAO組(P＜0.01,P＜0.05,表1)。

2.3 MLR對SMAO休克大鼠器官組織勻漿LBP、CD14含量的影響

MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 LBP、CD14含量與Sham組無明顯差異(P＞0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的LBP、CD14含量均顯著高于Sham組與MLR組(P＜0.01,P＜0.05),且 SMAO+MLR組肝 、肺 、腎 、心肌組織勻漿的CD14水平均顯著高于SMAO組(P＜0.01,P＜0.05,表 2,3)。

Fig.2 Effect of MLR on ET content of plasma in SMAO shock rats(EU/ml, ±s,n=6)

2.4 MLR對SMAO休克大鼠器官組織勻漿TNF-α含量的影響

MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 TNF-α含量與Sham組無明顯差異(P＞0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的TNF-α含量均顯著高于Sham組與MLR組(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的TNF-α水平均顯著高于SMAO組(P＜0.01,P＜0.05,表4)。

Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)

Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.240±0.058 0.200±0.016 0.151±0.025 0.292±0.063 MLR 0.373±0.049 0.244±0.035 0.188±0.040 0.381±0.082 SMAO 0.645±0.059**## 0.662±0.044**## 0.494±0.083**## 0.595±0.090**#SMAO+MLR 0.728±0.088**##△ 0.892±0.154**##△△ 0.585±0.072**##△ 0.746±0.142**##△

Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)

Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 1.008±0.123 3.299±0.443 1.237±0.250 1.739±0.463 MLR 1.180±0.093 3.206±0.465 1.355±0.290 1.851±0.385 SMAO 1.521±0.346*# 3.926±0.214*# 1.572±0.453**## 2.794±0.541**##SMAO+MLR 1.921±0.265**##△ 4.223±0.465**##△ 2.182±0.519**##△△ 3.040±0.474**##△

Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)

Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.964±0.079 0.812±0.183 0.387±0.082 0.538±0.066 MLR 1.058±0.164 0.831±0.195 0.444±0.093 0.668±0.033 SMAO 1.389±0.145*# 1.089±0.174*# 0.740±0.080*# 1.011±0.196**#SMAO+MLR 1.661±0.100**##△ 1.329±0.079**##△ 0.871±0.120**##△ 1.348±0.180**##△△

Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)

Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 27.90±5.47 36.33±6.54 21.05±3.41 26.58±7.32 MLR 28.05±4.56 38.85±7.90 22.41±4.77 28.87±5.69 SMAO 35.50±5.76*# 48.98±2.50*# 26.68±4.80*# 136.31±7.14**##SMAO+MLR 41.34±8.80**##△△ 56.28±9.27**##△△ 29.98±6.91**##△ 42.84±7.03**##△△

3 討論

炎癥介質大量釋放引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是多種致病因素導致多器官損傷甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的關鍵環節;內毒素移位至遠隔器官刺激單核巨噬細胞系統產生并釋放大量的炎癥介質是機體炎癥反應失控的主要因素之一[8]。為此,本文從內毒素經腸淋巴途徑移位的角度,探討MLR加重SMAO休克大鼠多個器官損傷的作用機制。

研究發現,SMAO休克組大鼠血漿以及肝、肺、心、腎等組織中ET的水平顯著增高,提示SMAO休克后器官損傷的機制與內毒素移位有關,其主要機制為缺血1 h引起腸粘膜缺血性損傷、再灌注2 h引起腸粘膜的再灌注損傷導致了腸屏障功能障礙,繼而引起了腸源性內毒素移位,導致血漿以及遠隔器官中ET水平提高。而行MLD與SMA同時夾閉1 h恢復再灌2 h的SMAO+MLR組大鼠血漿與肝、肺、心、腎組織勻漿的ET水平高于SMAO組,說明MLR加重了SMAO休克大鼠內毒素移位的程度,其作用機制與ET經腸淋巴途徑移位增多有關。實驗結果從ET角度證實了MLR加重SMAO休克的作用機制與腸源性內毒素移位有關,其機制可能與SMAO狀態下MLR引起了腸系膜微淋巴管損傷、腸源性內毒素通過腸系膜微淋巴管吸收和轉運增多有關。

研究表明,LPS不僅直接損傷內皮細胞,而且還與LBP相結合形成LPS-LBP復合物,在LBP運載下與單核巨噬細胞表面的CD14結合,激活免疫細胞,產生炎癥介質及細胞因子,促進組織損傷,可見,LBP和CD14這一組蛋白與內毒素引起炎癥介質釋放的作用機制關系密切[9]。同時,LBP的存在使LPS刺激合成炎癥介質TNF-α的閾值下降,并使LPS誘導激活巨噬細胞生成細胞因子的速度較LPS單獨作用時迅速增加,而抗LBP抗體可明顯抑制LPS刺激細胞產生TNF-α的能力;CD14可增強CD14+細胞對LPS的反應性;CD14-細胞在轉染CD14后對LPS的反應性可增強1000倍;可見 LBP/CD14不僅是LPS引起損傷的信號轉導途徑中的關鍵分子,而且具有顯著的LPS增敏效應,LBP/CD14系統也被稱作內毒素增敏系統[10]。本文通過檢測 LBP、CD14、TNF-α的研究發現,SMAO休克組大鼠肝、肺、心、腎等組織LBP、CD14的含量均顯著升高,成為LPS引發炎癥反應的重要環節,增高的TNF-α則是內毒素移位、LBP/CD14增加LPS作用的結果;SMAO+MLR組大鼠肝、肺、心、腎組織勻漿 LBP、CD14的含量顯著高于SMAO組,提示MLR增加了SMAO休克大鼠內毒素致敏系統的活性,這也是最終引起炎癥介質TNF-α釋放增多、加重組織器官炎癥反應與損傷的重要機制。

綜上,MLR增加了SMAO休克大鼠腸源性ET經腸淋巴途徑移位至遠隔器官,同時激活LBP/CD14系統,提高器官組織對腸源性ET的敏感性,誘導產生并釋放TNF-α等炎癥介質,加重炎癥級聯反應與器官損傷,腸源性內毒素移位在MLR加劇SMAO休克多器官功能障礙的發病學中具有重要的作用。研究結果也提示,通過對LPS-LBP/CD14系統及腸淋巴途徑的干預,可減輕SMAO休克的炎癥級聯反應,這對于防治器官損傷具有一定的參考價值及指導意義。

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