p38-MAPK信號通路在HHPH中的作用及三七總皂苷干預*

朱阿楠,王淑君,王園園,金可可,王萬鐵△

(1.溫州醫學院病理生理學教研室,浙江 溫州 325035;2.余姚市中醫醫院內科,浙江 余姚 315400)

低O2高CO2性肺動脈高壓(hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension,HHPH)發病的中心環節是肺血管阻力增加。目前研究[1,2]表明HHPH是由于多種因素刺激肺血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖,細胞外基質成分增多,非肌型動脈形成新肌層化,內皮細胞腫脹和肥大,最終導致肺動脈管壁增厚和管腔狹窄所致。至今,HHPH發生的細胞內信號機制仍未闡明。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號途徑作為各種刺激因子在細胞內信號傳遞的共同通路,在肺血管收縮和肺血管結構重建中所起的關鍵作用,是近年來關注的熱點之一。

1 材料與方法

1.1 慢性HHPH動物模型的復制

雄性SD大鼠72只(體重200～220 g),隨機分成6 組(n=12),即 N 、H3d、H1w、H2w、H4w和 Hp組 。 將后五組大鼠放入常壓低O2高 CO2艙內,艙內O2濃度維持在9%～11%,CO2濃度維持在5%～6%(艙內水蒸汽用無水 CaCl2吸收,多余二氧化碳用氫氧化鈉吸收),每天8 h,每周6 d。Hp組于每日進艙前半小時腹腔注射血塞通注射液[50 mg/(kg·d)],其余各組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。N組置于艙外,自由呼吸空氣。其他組均飼養在常壓低O2高CO2艙內,分別飼養3 d(H3d組)、1周(H1w組)、2周(H2w組)、4周(H4w、Hp組)。

1.2 模型是否成功的評估

每組隨機取10只大鼠。采用右心導管法自頸外靜脈插管至肺動脈,并行頸總動脈插管,經Power-Lab生理記錄儀分別測定平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)及平均頸動脈壓(mean carotid arterial pressure,mCAP)。放血處死動物,分別稱取右室(RV)和左室加室間隔(LV+S)的重量,并計算出RV/(LV+S)的重量比,作為右室肥大的指標。以mPAP、mCAP 、RV/(LV+S)%、作為判斷模型建立成功的指標。

1.3 肺細小血管顯微結構觀察

取肺組織,常規石蠟制片(厚度 5 μ m),HE染色,顯微鏡觀察并拍照。每只大鼠隨機選一張肺組織切片,每張切片隨機選直徑50 μ m～ 200 μ m 肺細小動脈5支,用美國IPP5.0(Image-pro plus)彩色圖像分析系統測定肺細小動脈管壁面積/管總面積(vessel wall area/total area,WA/TA),管腔面積/管總面積(vessel cavity area/total area,EA/TA)。

1.4 肺細小動脈p38MAPK的免疫組化檢測及結果處理

肺組織石蠟切片常規脫蠟至水,3%過氧化氫室溫處理10 min,滴加一抗(1∶100),37℃孵育1 h,再滴二抗、SABC、3,3一二氨基苯聯胺(DAB)顯色,陽性結果呈棕黃色。隨機選取直徑50～200 μ m的肺內動脈10條,采用美國IPP5.0(Image-pro plus)彩色圖像分析系統測定陽性部位及背景的光密度值,以陽性部位的光密度值減背景的光密度值代表陽性部位的吸光度(optical density,OD)值。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測肺組織中磷酸化p38MAPK蛋白含量及圖像處理

(1)各組取肺組織100 mg,剪碎、勻漿以充分裂解肺組織。超聲粉碎儀裂解細胞后吸取上清,分裝,-80℃保存。(2)BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度:根據標準曲線得出樣品的蛋白濃度,調節蛋白濃度,上樣量為40 μ g。(3)蛋白質電泳和印跡電轉移:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳配置質量分數為10%的分離膠和5%的濃縮膠,電泳條件:恒壓,先80 V,待溴酚藍到達分離膠后改電壓為130 V,直至溴酚藍跑到凝膠底部;電泳結束后進行印跡轉移,應用聚乙烯二氟(PVDF)膜380 mA恒流電轉40 min,轉移完畢后分別用立春紅和考馬斯亮蘭染膜和膠。(4)Western印跡分析:采用質量分數為5%BSA的TBS。T封閉液室溫封閉1 h,TBS-T洗膜3次后,加入單克隆兔抗大鼠磷酸化p38或單克隆兔抗大鼠總p38(總p38為磷酸化p38起校正內參的作用,濃度均為1∶1 000稀釋),于4℃孵育過夜,次日加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋),室溫置1 h;TBST洗膜3次,化學發光底物ECL顯色、膠片曝光,用UVP凝膠成像掃描系統對膠片條帶進行定量性密度測定,Quantity One軟件計算其灰度值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠平均肺動脈壓、體循環壓和右心指數的比較

2.1.1 各組大鼠 mCAP的比較 N組、H3d組、H1w組、H2w組、H4w組和Hp組大鼠間mCAP無明顯差異(P＞0.05,表1),說明低O2高CO2對大鼠的體循環壓沒有影響。

2.1.2 各組大鼠mPAP的比較 與N組相比,H3d組mPAP無明顯升高(P＞0.05)。隨著低O2高CO2時間的延長 ,H1w組 、H2w組、H4w組和Hp組的 mPAP均高于N組(P均＜0.05),且各組之間差異明顯(P＜0.05)。說明隨著低O2高CO2時間的延長,大鼠mPAP 1周時即開始明顯升高,4周后達到較高水平。同時可見 Hp組 mPAP明顯低于H4w組(P＜0.05,表1),說明PNS可減輕低O2高CO2的肺動脈高壓。

2.1.3 各組大鼠RV/LV+S的比較 隨著低O2高CO2時間的延長 ,H2w、H4w和Hp組的 RV/LV+S 均高于N 組(P均 ＜0.05),但H3d組、H1w組的RV/LV+S較N組增加不明顯(P均＞0.05)。說明隨著低O2高CO2時間的延長,大鼠2周后 RV/LV+S即開始明顯升高,而且逐漸增加,第4周達較高水平。同時可見Hp組 RV/LV+S明顯低于H4w組(P＜0.05,表1),說明PNS可減輕低O2高CO2大鼠的右心室肥厚。

Tab.1 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP,mCAP,RV/LV+S of rats(±s,n=10)

Tab.1 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP,mCAP,RV/LV+S of rats(±s,n=10)

mPAP:Mean pulmonary arterial pressure;mCAP:Mean carotid arterial pressure;R V/LV+S:Right ventricle/left ventricle+septum;N:Normal group;H3d:Hypoxic hypercapnia for 3-day group;H1w:Hypoxic hypercapnia for 1-week group;H2w:Hypoxic hypercapnia for 2-week group;H4w:Hypoxic hypercapnia for 4-week group;HP:PNS-injected group*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs H3dgroup;△P ＜0.05 vs H1wgroup;▲P＜0.05 vs H2wgroup;○P＜0.05 vs H4w group

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg)RV/LV+S(%)N 11.00±0.62 107.46±6.40 23.41±0.97 H3d 11.84±0.49 110.13±5.44 24.29±1.02 H1w 13.54±0.65*# 109.19±4.99 24.76±1.04 H2w 16.85±0.88*#△ 108.03±4.9230.19±0.95*H4w 23.12±0.53*#△▲ 114.85±9.8736.04±0.65*#△Hp 18.74±0.74*#△▲○106.32±6.3431.57±0.69*#△○

2.2 光鏡下各組大鼠肺細小動脈結構的比較

光鏡下所見,N組,平滑肌層未見明顯增生,管壁均勻一致,而隨著缺氧間期的延長,H1w組、H2w組、H4w組和Hp組內彈力板扭曲明顯,中膜平滑肌細胞增生,管腔明顯狹窄,但H3d組改變不明顯(圖1A,1F,圖1見彩圖頁Ⅳ)。Hp組與H4w組比較,其血管壁的改變明顯減輕(圖1E,1F)。隨著低O2高CO2時間的延長,H1w、H2w、H4w和Hp組的WA/TA 均高于N組(P均＜0.05),但H3d組較N組增加不明顯(P＞0.05)。說明隨著低氧時間的延長,大鼠1周后肺小動脈管壁開始增厚,第4周達較高水平。同時可見Hp組WA/TA明顯低于H4w組(P＜0.05),說明PNS可減輕低O2高CO2大鼠肺小動脈管壁增厚。EA/TA則相反(表2)。

Tab.2 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling of rats(%,±s,n=8)

Tab.2 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling of rats(%,±s,n=8)

WA/TA:Vessel wall area/total area;EA/TA:Vessel cavity area/total area;N:Normal group;H3d:Hypoxic hypercapnia for 3-day group;H1w:Hypoxic hypercapnia for 1-week group;H2w:Hypoxic hypercapnia for 2-week group;H4w:Hypoxic hypercapnia for 4-week group;HP:PNS-injected group*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs H3dgroup;△P＜0.05 vs H1wgroup;▲P＜0.05 vs H2wgroup;○P＜0.05 vs H4w group

Group WA/TA EA/TA N 28.71±2.56 71.39±2.56 H3d 30.20±2.31 69.80±2.31 H1w 35.26±2.04*# 64.74±2.04*#H2w 44.10±2.29*#△ 55.90±2.29*#△H4w 54.98±4.21*#△▲ 45.02±4.21*#△▲Hp 46.38±1.02*#△○ 53.62±1.02*#△○

2.3 各組肺組織勻漿磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)Western blot結果比較

各組肺組織勻漿P-p38MAPK灰度值變化為N組P-p38 MAPK未見表達,隨著低O2高CO2進展,p38MAPK活性逐漸增強,H1w組達到高峰(圖2),灰度值(0.362±0.087),此后一直維持在較高水平,H2w、H4w和H1w組之間無統計學差異。Hp組 P-p38 MAPK明顯低于H1w、H2w、H4w組但仍高于正常對照組水平(P＜0.05,表3)。

Fig.2 Western blot analysis of P-p38MAPK expression in lung homogenate

2.4 各組肺小血管壁磷酸化p38MAPK蛋白表達變化

各組肺小動脈壁 P-p38MAPK蛋白吸光度值比較N組和H3d組肺小動脈壁P-p38MAPK表達呈陰性或弱陽性(圖3A、3B,圖3見彩圖頁Ⅳ),隨著低O2高CO2進展,其在肺小動脈壁上的表達逐漸增強(表4),低氧1周時P-p38MAPK在大鼠肺小動脈壁核表達呈陽性(圖3C),低O2高CO2兩周,4周時也有較強活性(圖3D,3E)。PNS治療組P-p38MAPK表達減弱(圖3F,表3)

Tab.3 Western blot analysis of P-p38MAPK expression in lung homogenate(±s,n=6)and expression of P-p38MAPK protein in pulmonary arterial walls(±s,n=10)

Tab.3 Western blot analysis of P-p38MAPK expression in lung homogenate(±s,n=6)and expression of P-p38MAPK protein in pulmonary arterial walls(±s,n=10)

N:Normal group;H3d:Hypoxic hypercapnia for 3-day group;H1w:Hypoxic hypercapnia for 1-week group;H2w:Hypoxic hypercapnia for 2-week group;H4w:Hypoxic hypercapnia for 4-week group;HP:PNS-injected group*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs H3dgroup;△P＜0.05 vs H1wgroup;▲P＜0.05 vs H2wgroup;○P＜0.05 vs H4w group

Group P-p38MAPK in lung homogenate P-p38MAPK in pulmonary arterial walls N 0.012±0.006 0.099±0.015 H3d 0.225±0.071* 0.107±0.013 H1w 0.362±0.087*# 0.124±0.025*H2w 0.424±0.061*# 0.151±0.016*#△H4w 0.364±0.071*# 0.150±0.028*#△Hp 0.193±0.044*△▲○ 0.131±0.021*#▲○

3 討論

本實驗結果表明,隨著低O2高CO2時間的延長和模型復制的進展,大鼠肺動脈平均壓和右心指數呈動態增高,兩周組和4周組均顯著高于正常對照組,光鏡下顯示肺細小動脈內彈力板扭曲,中層平滑肌及外膜膠原纖維增生,管腔狹窄,說明低O2高CO2肺動脈高壓和右心室肥厚模型已建立成功。肺血管重建不但是肺動脈高壓持續發展的關鍵因素,而且是對血管擴張降壓藥物產生抵抗的主要原因。目前認為,在低O2、高碳酸等各種刺激因子作用下,肺動脈平滑肌細胞增殖以及膠原等細胞外基質在管壁大量沉積是肺動脈重建的最主要的原因。我們的實驗發現:隨著低O2高CO2時間的延長,(1)大鼠mPAP 1周后即開始明顯升高,4周時達到高峰。(2)2周組RV/LV+S即開始明顯升高,4周達最高水平。(3)2周組、4周組內彈力板扭曲明顯,中膜平滑肌細胞增生,管腔明顯狹窄。說明在HHPH形成過程中出現明顯的肺血管重建。

Kato等[3]研究表明血小板源生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)對新生內膜的VSMC和成熟的中膜VSMC的MAPK激活有相同的作用。Su[4]等發現 ROS通過p38MAPK信號通路促進了VSMC分化。Viedt等[5]觀察到 ROS調節了AngⅡ誘導的JNK和p38MAPK激活,使大鼠VSMCs增殖加快,認為表型轉化可能與ROS激活了MAPK通路有關。Kavurma等[6]研究證明不同細胞亞型的增殖和遷移是MAPK依賴性的,并證明SMC異質性至少部分地被特定的MAPK通路所調節。我們的實驗也發現,(1)肺組織P-p38MAPK水平在1周時即達到峰值,且此后一直維持在峰值水平。(2)肺小動脈壁P-p38MAPK蛋白吸光度值變化基本同肺組織勻漿Western blot結果一致;且隨著低O2高CO2進展,其主要表達在肺小動脈中膜和內膜,外膜也有少量表達。這些結果表明低O2高CO2能夠引起p38MAPK通路的活化;P-p38MAPK在HHPH中呈動態變化;它們的活化參與了肺動脈高壓的形成以及肺血管的重建。但我們的實驗結果與文獻報道并不完全一致:孔春初[7]等采用單純低O2復制大鼠肺動脈高壓,P-p38MAPK在正常組和各低氧組肺組織均未見表達,造成實驗結果差異的機理尚不清楚,有可能是高碳酸血癥增強P38 MAPK活化。值得一提的是,P-p38MAPK蛋白在低O2高CO23d時活性增強,在1周達到高峰后一直保持在高活化狀態。說明低O2高CO2中晚期參與血管重塑的主要通路可能是p38MAPK。Nagata研究[8]發現,p38 MAPK促進凋亡或抑制凋亡與p38 MAPK激活的性質有關,如短期p38MAPK的激活可引起造血腫瘤細胞KT6分化,而長時間的激活則可促進其凋亡;在TNF-α處理的中性粒細胞中早期p38的激活可延遲凋亡,而晚期p38的激活可加速凋亡。因此,也可以認為中晚期p38 MAPK高活化狀態是一種保護機制,以此來對抗低O2高CO2引起的肺血管壁增殖重塑。p38 MAPK在HHPH中晚期的作用機制有待于進一步研究。

三七總皂苷(panax notogino side,PNS)具有擴張血管、降低血液粘度等多種作用 。我們的實驗結果顯示,PNS用藥組大鼠與慢性HHPH模型組大鼠相比,平均肺動脈壓和右心室重量比都有不同程度的降低,而頸總動脈壓無明顯改變,提示PNS可抑制或預防慢性HHPH的形成而對體循環壓無明顯影響,即對HHPH具有選擇性抑制作用。光鏡下Hp組肺細小動脈內彈力板扭曲明顯減輕,中層平滑肌變薄,WA/TA明顯降低,LA/TA顯著升高。提示PNS具有抑制慢性HHPH大鼠的肺血管結構重建作用。以往研究表明[9],PNS可通過增加血漿、肺組織中NOS活性和NO含量,增加血漿中T-SOD、Cu/ZnSOD活性,降低紅細胞比積和減輕內皮細胞損傷而實現防治慢性低氧性肺動脈高壓的形成。周曉霞[10]研究提示 PNS的抗動脈硬化作用可能是通過抑制VSMC異常增殖實現的。我們的實驗表明,Hp組大鼠肺組織,肺動脈壁上的P-p38MAPK蛋白表達均有下降,同時Hp組肺血管結構重建較4周組 顯著減輕,說明PNS能夠抑制p38MAPK通路活性,從而減輕肺動脈高壓的程度。

[1]Fagan K A,Oka M,Bauer N R,et al.Attenuation of acute hypoxic pulmonary vasoconstriction and hypoxic pulmonary hypertension in mice by inhibition of Rho-kinase[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004,287(4):L656-664.

[2]Nagaoka T,Morio Y,Casanova N,et al.Rho/Rho-kinase signaling mediates increased basal pulmonary vascular tone in chronically hypoxic rats[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physio l,2004,287(4):L665-672.

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[5]Viedt C,Soto U,Krieger-Brauer H I,et al.Differential activation of mitogen-activated protein kinases in smooth muscle cells by angiotensin II:involvement of p22phox and reactive oxygen species[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(4):940-948.

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