丁苯酞對酒精依賴大鼠海馬谷氨酸含量及NR2B表達的影響*

杜愛林,李 爽,姜洪波,李文強,郝 偉,張瑞嶺△

(1.新鄉醫學院生理學教研室,2.河南省生物精神病學重點實驗室,3.二附院,4.三附院,新鄉 453003)

酒精依賴或稱為酒癮,是一種非要飲酒不可的強迫心理狀態,可以連續或周期性出現。丁苯酞(butylphthalide,NBP)是我國成功研制出的具有自主知識產權的一類化學新藥,主要用于治療缺血性腦卒中。研究表明,NBP可抑制谷氨酸釋放,抑制Ca2+內流[1]。本實驗通過觀察NBP作用于酒精依賴大鼠后,戒斷癥狀評分、海馬谷氨酸(Glu)含量及N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate acceptor)2B亞基(NR2B)mRNA表達變化,探討NBP對酒精依賴大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備

鄭州大學動物中心提供清潔級成年健康SD雄性大鼠50只(許可證號:scxk(豫)2005-0001),體重200～220 g,隨機分為五組(n=10),分別為A:正常組,B:酒精依賴模型組,C:NBP低劑量組,D:NBP中劑量組,E:NBP高劑量組,各組平均體重差別無統計學意義。除正常組外,各組飲含6%(v/v)酒精水溶液28 d[2]。14 d后,NBP用植物油稀釋后每日灌胃一次,劑量為低劑量組NBP 10 mg/kg,中劑量組NBP 20mg/kg,高劑量組NBP 40 mg/kg,正常組和酒精依賴模型組等劑量植物油灌胃5 ml/kg。

1.2 藥品及試劑

丁苯酞由石藥集團恩必普藥業有限公司提供。Trizol試劑、SYBR·Premix Ex TaqTM II試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司、引物由上海生工生物工程有限公司合成。谷氨酸標準液購自上海康達氨基酸廠。

1.3 戒斷評分

各組動物按Erden等[3]戒斷評分表于末次飲酒后6 h觀察戒斷癥狀18 min。主要觀察指標為大鼠戒斷行為體征(刻板行為、激惹性、尾巴強直、異常姿勢)和聽源性癲癇發作情況。

1.4 高效液相色譜分析谷氨酸水平[4]

大鼠麻醉斷頭,剝離海馬稱重,加入1 ml甲醇-水離心液,低溫勻漿,取部分勻漿液4℃,10 000×g,離心15 min,取上清,濾膜過濾后-80℃保存待測。組織中含量以μ g/g計。樣品經OPA(O-phthalaldehyde)衍生后,用高效液相色譜儀(美國VARIAN Prostar)分析。流速1.0ml/min、激發波長250 nm,發射波長410 nm,以GLU峰面積定量。

1.5 實時熒光定量PCR反應

1.5.1 cDNA制備 快速斷頭處死各組試驗動物,冰盤上操作取海馬區腦組織50～100 mg,立即放入Trizol試劑中進行RNA抽提。以260 nm及280 nm吸光度值計算所獲RNA含量及純度,分裝后-70℃保存。逆轉錄過程按試劑盒說明書操作。

1.5.2 PCR引物設計 根據標準熒光定量PCR引物設計原則,通過Primer 5.0程序設計,NR2B引物序列為:上游引物:5′-CTT ACT GAA GGC AAT CCT CG-3′,下游引物:5′-TCC TCA GAA CAC CTT CGC TT-3′;ACTIN 引 物序 列 為上 游引物:5′-ATGGATGACGATATCGCTGCG-3′,下 游 :5′-TCGTCCCAGTTGGTGACAATG-3′,由上海生工生物工程公司合成。

1.5.3 PCR 過程 SYBR·Premix Ex TaqTM(2 ×)12.5 μ l、NR2B/ACTIN F(10 pmol/L)1 μ l、NR2B/ACTIN R(10 pmol/L)1 μ l、模板 cDNA 2μ l、ddH2O 8.5μ l(總體積 25μ l)于 PCR 反應管中。在FTC-2000型熒光定量PCR儀(加拿大楓嶺生物技術(上海)有限公司)上行PCR,擴增條件如下:(1)95℃3 min預變性;(2)95℃20 s變性,60℃30 s退火延伸,40個循環。

1.5.4 熒光實時定量PCR分析 分別測定每個樣品NR2B和ACTIN mR NA的Ct值,每個樣品均作復孔以減少操作誤差。采用相對定量方式表示各樣品NR2B的△Ct,△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。再依據△△Ct=△Ct目的基因△Ct參照因子,計算 2-△△Ct。對PCR反應過程中的每一循環的系統熒光強度進行實時監測,根據擴增曲線確定Ct值(cycle threshold),利用2-△△Ct法計算NR2BmRNA相對拷貝數。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 丁苯酞對酒精成癮大鼠戒斷評分的影響

戒斷評分結果顯示,酒精成癮可使大鼠戒斷評分明顯增加,中高劑量丁苯酞均可使大鼠戒斷評分下降(表1)。

Tab.1 Effect of NBP on the ratswith alcohol addiction(±s,n=10)

Tab.1 Effect of NBP on the ratswith alcohol addiction(±s,n=10)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs low-dose group

Group Score withdrawal syndrome Glutamate(μ mol/g) NR2B Control 10.38±1.40 3.21±0.60 1.03±0.14 Model 13.22±2.27**0.35±0.06**3.78±0.49*Low-dose 13.51±2.63 0.31±0.07 3.21±0.65 Medium-dose 11.37±1.19#△0.29±0.07 1.37±0.89#△High-dose 11.28±1.08#△0.28±0.06 1.74±1.19#△

2.2 丁苯酞對酒精成癮大鼠海馬區谷氨酸含量的影響

高效液相色譜分析結果顯示,酒精成癮可使大鼠海馬區谷氨酸含量明顯減少,各劑量丁苯酞對酒精成癮所引起的大鼠海馬區谷氨酸含量減少沒有明顯影響(表1、圖1)。

2.3 丁苯酞對酒精成癮大鼠海馬區NR2B mRNA含量影響

熒光實時定量PCR結果顯示,酒精成癮可使大鼠海馬區NR2B mRNA表達明顯上升,中、高劑量丁苯酞使大鼠海馬區NR2B mRNA表達減少(表1、圖2)。

3 討論

丁苯酞(butylphthalide,NBP)具有較強的抗腦缺血作用,能改善腦能量代謝和缺血腦區的微循環,抑制神經細胞凋亡,并具有抗腦血栓形成和抗血小板聚集作用。NBP可能通過降低花生四烯酸含量,提高腦血管內皮NO和PGI2的水平,抑制谷氨酸釋放,降低細胞內鈣濃度等機制而產生上述藥效作用。

Fig.1 HPLC chromatograms of Glu in the hippocampus of rats

本研究采用給大鼠自由飲含6%酒精(v/v)的水溶液28 d的方法,建立酒精依賴大鼠模型[2]。本研究酒精依賴模型組大鼠在酒精撤除6 h后,綜合評分明顯比正常組高,有顯著性差異,表明酒精依賴大鼠模型制作成功。給予丁苯酞(butylphthalide,NBP)中、高劑量干預后,綜合評分降低,與實驗對照組相比有顯著性差異,表明NBP能夠減輕酒精戒斷癥狀。為了探討NBP的神經保護作用機制,我們分別檢測了大鼠海馬區谷氨酸(Glu)含量和NMDA受體亞基NR2B蛋白表達。

Fig.2 Amplification curve of NR2B mRNA in the hippocampus of rats

在哺乳動物腦內,海馬(hippocampus)與酒精成癮密切相關。而腦組織中谷氨酸(Glu)受體N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基(NR2B)在海馬組織有豐富表達。研究表明,酒精能夠通過作用于NR2B受體,造成神經細胞損傷和成癮。本實驗結果表明,酒精成癮大鼠海馬區Glu含量較正常組顯著降低(P＜0.01),而NR2B mRNA表達明顯升高。這與既往研究結果一致。加入NBP后,酒精成癮大鼠海馬區NR2B mRNA表達明顯下降,但是海馬區Glu含量無顯著性差異(P＞0.05)。說明NBP可以下調酒精成癮引起的海馬區NR2B mRNA表達,但是其作用途徑與Glu無關。

NR2B表達上調可導致過量飲酒及復發。NMDA受體被激活后,觸發Ca2+等陽離子的內流,使神經元逐步壞死。NBP能夠減輕細胞內鈣超載,NBP中、高劑量組與實驗對照組比較,海馬組織NR2BmRNA表達明顯降低,差異具有顯著性,提示NBP可能通過使NR2B mRNA表達下調,使NMDAR數量減少,進而抑制Ca2+內流,減輕細胞內 Ca2+超載,使大鼠戒斷癥狀減輕。

本研究為NBP的神經保護作用提出了新的可能機制,對于指導酒精成癮的臨床治療也具有一定的理論意義。

[1]秦榮新,梁健成.丁基苯酞的藥理及臨床研究進展[J].海峽藥學,2009,21(1):100-101.

[2]李 菁,袁孝如,李躍華,等.酒精依賴大鼠模型建立[J].中國藥物依賴性雜志,2006,15(6):433-436.

[3]Gray S,Borgundvaag B,Sirvastava A,et al.Feasibility and reliability of the SHOT:A short scale for measuring pretreatment severity of alcohol withdrawal in the emergency department[J].Acad Emerg Med,2010,17(10):1048-1054.

[4]俞軍齡,陳再興,毛小元,等.HPLC法測定tremor大鼠腦組織中谷氨酸和GABA含量[J].中國藥理學通報,2009,25(11):1530-1533.

[5]Kash T L,Matthews R T,Winder D G.Alcohol inhibits NR2B-containing NMDA receptors in the ventral bed nucleus of the stria terminalis[J].Neuropsychopharmacol,2008,33(6):1379-1390.