響應面法優化蘇云金芽孢桿菌產耐熱蛋白酶的發酵培養優化

邱婷玉 鄭 毅 陳 燕

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響應面法優化蘇云金芽孢桿菌產耐熱蛋白酶的發酵培養優化

邱婷玉 鄭 毅 陳 燕

福建師范大學生命科學學院

采用二水平Plackett-Burman實驗設計對影響發酵培養基的8個成分進行顯著性分析，確定最重要的3因素為葡萄糖、酵母膏和ZnSO4；應用響應面分析法對這3個因素進行3水平優化，獲得它們的最優組合，得到優化后的最佳發酵培養基配方(g/L)：黃豆餅粉12、酵母膏4.24、葡萄糖5.43、KH2PO42、ZnSO40.39、MnSO40.42。優化后產酶水平達到6473U/mL, 與響應面數學模型的預測值僅有0.49%的誤差。

蘇云金芽孢桿菌 Plackett-Burman設計 響應面分析法 蛋白酶

0 引言

蛋白酶是一種重要酶制劑，廣泛應用于食品工業、生物制藥工業、化學洗滌劑工業、皮革工業，具有很高的應用前景和商業價值。耐熱蛋白酶又因其具有較強的熱穩定性而逐漸被人們重視[1]。本文對篩選到的1株產耐熱蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌FS42的產酶培養基進行優化，采用Plackett-Burman實驗設計和響應面分析法（Response Surface Methodology，簡稱RSM）對發酵培養基進行優化，以快速提高該菌株產酶能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

蘇云金芽孢桿菌(，簡稱Bt)菌株FS42，為本實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養基

（1）斜面培養基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、瓊脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2；

（2）種子培養基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、瓊脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2；

（3）始發酵培養基(g/L)：黃豆餅粉1.5g、葡萄糖0.5g、酵母膏0.7g、KH2PO40.25g、MgSO4·7H2O 0.035g、CaCO30.05g, pH為7.0。

1.2 方法

1.2.1 發酵培養方法

由斜面接一環到50mL(250mL的三角瓶）的種子培養基中，于31℃、230 r/min 的恒溫搖床培養13h，制成液體菌種，然后按2%的接種量接入到裝液量為35mL(250mL的三角瓶)的發酵培養基中，在31℃、230r/min的條件下進行發酵培養。

1.2.2 Plackett-Burman設計優化

采用多因素二水平的Plackett－Burman試驗設計方法，對培養基各成分進行顯著性篩選，并進行排序，以期獲得三個顯著性因素，進行響應面設計優化[2,3]。

1.2.3 響應面設計優化

根據響應面分析法的BOX-Behnken設計，對三個顯著性因素進行優化，優化三個因素的最佳水平點，獲得最佳優化配方，同時驗證[2,3]。

1.2.4 蛋白酶活力的測定

采用酪蛋白（SIGMA產品）為底物，采用紫外分光度法進行測定[4]。酶活力單位定義：在pH 7.2、50℃的條件下每1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計篩選重要因素

采用Plackett-Burman實驗設計對培養基配方各組分（包括：黃豆粉，葡萄糖，酵母膏，K2HPO4，ZnSO4·7H2O，MnSO4·H2O，CaCO3，初始pH）進行重要性篩選，確定對產酶影響顯著的因素。選擇=12的8因素2水平的Plackett- Burman試驗設計，進行培養基優化。以發酵培養基配方的不同組分作為優化輸入因子，輸入因子1～8分別代表黃豆粉，酵母膏，葡萄糖，K2HPO4，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O，MnSO4·H2O，CaCO3，pH，每項均取低(-1)和高(+1)兩水平，見表1，響應值為蛋白酶的酶活力，表中每列代表每種因素的不同水平。

表1 N=12的Plackett-Burman試驗設計方案及試驗響應值

Plackett-Burman試驗的二水平分析目的：在其它因素不變的情況下，分析某因素的變化對響應的影響，從而得出影響培養基組成的主效應因素，結果見表2。結果表明：培養基成分葡萄糖、酵母膏、初始pH以及ZnSO4·7H2O可信度均大于88.47%，為顯著因子，顯著性排序為葡萄糖>酵母膏>初始pH>ZnSO4·7H2O。

表2 Plackett- Burman試驗設計因素水平及顯著性

2.2 響應面BOX-Behnken試驗設計優化

2.2.1 試驗設計與結果

從一階試驗設計Plackett-Burman試驗設計結果獲得進入二階試驗設計的三因素：酵母粉、葡萄糖和ZnSO4三個顯著因子，將三因素設定三水平(-1,0,1)，各水平設計見表3，試驗設計及結果見表4，為三因素三水平15個試驗點，實施設計后得到試驗數據，進行二次回歸擬和，得到交互項和平方項的二次方程，分析因素之間的主效應和交互效應，求得三因素的最佳水平組合[5,6]。由表4可見，試驗實測值與模擬值之間誤差較小，擬和較好。

表3 培養基優化的因素和水平

表4 BOX-Behnken設計矩陣和響應數據的實測值與擬合值

2.2.2 二次響應面回歸模型的建立

利用SAS統計軟件的二次響應面回歸（RSREG）進行數據分析，參數估計值見表5，建立得到擬合二次回歸方程如下：

方程回歸分析及方差分析見表5?；貧w方程的決定系數 R2=0.9071 ，說明該二次回歸方程的擬合程度較好，總模型回歸值為0.038566，說明模型回歸顯著；方差分析顯示，線性回歸、二次回歸值小于0.05，均為顯著，因此該模型可以用于FS42產耐熱蛋白酶發酵優化的理論預測。

表5 回歸方程方差分析表

2.3 發酵優化最佳配方組合的獲得及驗證

在獲得非線性回歸模型和響應面之后，為了求得培養基最佳濃度,對所得的回歸擬和方程分別對各自的變量求一階偏導數，并令其為0得到三元一次方程組，求解此方程組可以得到最大產酶量時的最佳條件[5,6]。即:1=0.83（5.43g/L），2= -0.11（4.24g/L），3=1.33（0.39g/L），=6441.51，也即三因素最佳組合為：葡萄糖5.43g/L 、酵母膏4.24g/L、ZnSO4為0.39g/L，此條件下理論預測最大酶活力為6441.51U /mL。

回歸模型試驗驗證：根據此優化組合進行試驗驗證得到實際酶活力為6473 U/mL，實測值比預測值誤差0.49%，可見該模型較好地預測了試驗結果，說明應用響應面優化產高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌的液體發酵培養基可行有效。

3 結論

本文對蘇云金芽孢桿菌FS42產耐熱蛋白酶的液體發酵培養基進行優化。通過Plackett-Burman設計對FS62發酵培養基的8個因素：葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CaCO3和初始pH值進行重要性篩選，篩選到3個重要因素，即酵母粉、葡萄糖和ZnSO4。用BOX-Behnken試驗設計對它們的配比進行3因素3水平試驗設計優化。利用SAS軟件進行響應面回歸分析得到相應的回歸方程，并由此獲得最優的濃度配比值，得到優化后的最佳的發酵培養基配方(g/L)為:黃豆餅粉12、酵母膏4.3、葡萄糖5.42、KH2PO42、ZnSO40.39、MnSO40.42。經試驗，優化后產酶水平顯著提高，達到6473U/mL，與RSM預測值誤差僅為0.49%，達到試驗預期目標。

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