解毒護(hù)肝飲藥物血清對異煙肼致HepG2壞死和凋亡的干預(yù)

楊鉑 劉靚雯 王小利 袁成民 安勇

中醫(yī)藥對于抗結(jié)核藥引起的藥物性肝炎有較好臨床療效，但是由于體外實(shí)驗(yàn)研究模型不穩(wěn)定，深入的療效機(jī)制研究少見。本實(shí)驗(yàn)建立了異煙肼致人肝癌細(xì)胞株(human hepatocellular carcinoma cell lines，HepG2)細(xì)胞壞死和凋亡的細(xì)胞模型，制備解毒護(hù)肝飲藥物血清干預(yù)，旨在發(fā)現(xiàn)其抗肝細(xì)胞損傷的療效并分析其形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RPMI1640培養(yǎng)液(美國GBCO公司)；小牛血清(美國GBCO公司)；流式細(xì)胞儀(雙激光、六色)[美國BD公司(FACS Canto)]；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Biosciences)；FITC CD95(20 μl/test)及溶血素(BD公司)；PE anti-human CD95 Ligand(5 μl/test)(eBioscience公司)；異煙肼注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號：0809162，規(guī)格：100 mg/2 ml)；HepG2細(xì)胞株(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院孟紅教授贈)。

1.2 藥物血清的制備

1.2.1 動物 雄性wistar大鼠15只，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，(200±20)g，許可證號：SCXK(魯)20090001，NO：0009272。環(huán)境：山東省中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級，許可證號：SYXK(魯)20050052。

1.2.2 藥物 茵陳30 g、生甘草15 g、赤芍15 g、大黃6 g、梔子10 g、生地黃10 g、枸杞15 g、郁金10 g、白茅根15 g、白術(shù)15 g、砂仁9 g。上述藥物水煎濃縮混勻后配制成100 ml水混懸液，充分混勻后給藥。相當(dāng)于臨床等效量的倍數(shù)計(jì)算：按人與大鼠體表面積換算法計(jì)算大鼠一日臨床等效量[1]：150 g(成人一日量)×0.09/kg=13.5 g/kg。甘草酸二銨膠囊：同樣計(jì)算方法，臨床一日等效量150 mg×0.09/kg=13.5 mg/kg。

1.2.3 方法 隨機(jī)分為正常組、甘草酸二銨膠囊組、中藥組，每組5只，分別給予蒸餾水和上述含甘草酸二銨及中藥的混懸液。灌胃給藥，連續(xù)7天，末次灌胃90分鐘后，離心收集血清，56℃滅活30分鐘，經(jīng)0.22 μm濾器抽濾除菌后-70℃保存，備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方法

以HepG2細(xì)胞為研究對象。參考Schwab CE的方法[2]，取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種6孔板，每孔1×105細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)共分為空白組、模型組、甘草酸二銨膠囊組，解毒護(hù)肝飲中藥組(簡稱中藥組)。后兩組培養(yǎng)液用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制含甘草酸二銨膠囊和中藥10%濃度的鼠血清；空白組和模型組為RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制的10%正常鼠血清。選擇并配制異煙肼濃度為4 mg/ml，接種于除空白組外其他組細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，記錄各組細(xì)胞不同程度的病變效應(yīng)并分別收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 顯微鏡下觀察細(xì)胞不同程度的病變效應(yīng)

1.4.2 凋亡檢測 收集的細(xì)胞用PBS洗2次，1×結(jié)合緩沖液重懸1×106細(xì)胞。取100 μl(1×105細(xì)胞)加入到絕對計(jì)數(shù)管。加5 μl FITC AnnexinV和5 μl PI。輕輕渦旋細(xì)胞，室溫孵育15分鐘。加400 μl 1×結(jié)合緩沖液，待檢，1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測。

1.4.3 Fas/FasL(CD95/ CD95 Ligand)檢測 收集培養(yǎng)24小時(shí)的HepG2細(xì)胞，PBS洗兩次，PBS重懸細(xì)胞。取100 μl(1×106)細(xì)胞加入到絕對計(jì)數(shù)管。加20 μl FITC CD95和5 μl PE anti-human CD95 Ligand。輕輕渦旋細(xì)胞，室溫避光孵育15～30分鐘。加2 ml PBS，1000 轉(zhuǎn)/分離心。棄上清，加入500 μl鞘液，待檢。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察各組HepG2細(xì)胞病變情況

與空白組細(xì)胞相比，模型組細(xì)胞發(fā)生腫脹變性及細(xì)胞脫落死亡的情況嚴(yán)重，中藥組和甘草酸二銨膠囊組都相對較輕，中藥組細(xì)胞損傷情況略優(yōu)于甘草酸二銨膠囊組。見圖1。

2.2 各組HePG2細(xì)胞凋亡和壞死情況

Annexin V/PI染色中AnnexinV+為早期凋亡，PI+為壞死，AnnexinV+/PI+為壞死或晚期凋亡，以上各項(xiàng)相加為細(xì)胞總死亡率。模型組細(xì)胞的死亡率最高，達(dá)36.9%，甘草酸二銨膠囊組和中藥組死亡率明顯下降，分別為18.4%和14.4%，中藥組略優(yōu)于甘草酸二銨膠囊組。模型組細(xì)胞凋亡率達(dá)18.1%，甘草酸二銨膠囊組和中藥組凋亡率明顯下降，分別為4.1%和3.2%，中藥組同樣優(yōu)于甘草酸二銨膠囊組。見表1。

圖1 HepG2細(xì)胞顯微鏡下病變效應(yīng)

組別PI+Annexin+/PI+Annexin+合計(jì)空白組09452781模型組69119181369甘草酸二銨膠囊組766741184中藥組813132144

2.3 Fas/FasL表達(dá)率

與空白組相比，模型組的Fas/FasL染色率明顯增加，分別為11.6%和22.1%，甘草酸二銨膠囊組和中藥組相應(yīng)數(shù)值明顯減小，中藥組表達(dá)率尤其更低，分別為6.7%和8.2%。提示解毒護(hù)肝飲可以降低Fas和FasL的表達(dá)。見表2。

表2 Fas/FasL染色率(%)

3 討論

N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶是異煙肼肝內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，根據(jù)其代謝效率分為快乙酰化和慢乙酰化兩種類型，而慢乙酰化者使異煙肼在體內(nèi)的代謝中產(chǎn)物得以蓄積，這些產(chǎn)物正是導(dǎo)致異煙肼肝毒性的主要物質(zhì)。Cho HJ[3]、Huang YS[4]等觀察發(fā)現(xiàn)慢乙酰化者發(fā)生異煙肼肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)為快乙酰化者的3.8倍，慢乙酰化者發(fā)生肝損傷時(shí)轉(zhuǎn)氨酶水平更高，認(rèn)為乙酰轉(zhuǎn)移酶的快慢分型是可以用來預(yù)測抗結(jié)核藥介導(dǎo)的肝毒性損傷的有效手段。而既往國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的異煙肼肝損傷模型多以動物或者原代人肝細(xì)胞為研究對象，由于很難保證其種屬一致及確定為慢乙酰化基因的肝細(xì)胞株，其重復(fù)性差。正如沈沖等[5]指出由于異煙肼代謝有關(guān)的細(xì)胞色素P450酶個(gè)體差異和種屬差異都較大，因此以不同的動物模型[6，7]為肝毒性評價(jià)體系的試驗(yàn)中得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論存在很大不確定性。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的HepG2是一個(gè)肝腫瘤細(xì)胞系，可以用于評價(jià)肝細(xì)胞毒性的研究[8，9]。用HepG2來評價(jià)異煙肼造成的肝損傷的理論依據(jù)在于HepG2是慢乙酰化肝細(xì)胞[10]。本試驗(yàn)建立了穩(wěn)定的異煙肼致HepG2損傷模型，為進(jìn)一步的研究提供了研究平臺。

抗結(jié)核藥引起肝損傷在中醫(yī)辨證體系中有自身的特點(diǎn)。首先本病以癆病為基礎(chǔ)，癆病病理性質(zhì)的特點(diǎn)為陰虛火旺，正如《丹溪心法·癆瘵》所言“癆瘵主乎陰虛”。因此本病的發(fā)生首先有一個(gè)陰虛火旺的病理基礎(chǔ)。其次，藥毒直接傷肝，這種藥源性病因不屬于傳統(tǒng)中藥，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明抗結(jié)核藥物可直接在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝毒物質(zhì)損傷肝臟。中醫(yī)理論認(rèn)為肝體即肝臟器官本身的物質(zhì)基礎(chǔ)[11]，肝體陰用陽，肝體受損不足引起肝用不達(dá)。一方面，不能正常疏泄氣機(jī)，引起氣郁，木郁則化火、成瘀；另一方面，肝不助脾胃運(yùn)化進(jìn)而產(chǎn)生濕、痰。最終形成濕熱痰瘀互結(jié)、肝陰不足的復(fù)雜證候。本方重用茵陳、生甘草為君藥，解毒清熱利濕；臣以生地、枸杞滋陰柔肝以補(bǔ)肝體，梔子、大黃增強(qiáng)君藥清熱利濕解毒的功效，與茵陳合用構(gòu)成茵陳蒿湯，為清利肝膽濕熱之名方，郁金疏肝利膽助肝用；佐以白茅根清熱利濕退黃使邪有出路，利水而不傷陰，白術(shù)、砂仁健脾助運(yùn),防肝病之傳變，也防止方中苦寒之品傷及脾胃，赤芍涼血活血除肝經(jīng)瘀熱。《張氏醫(yī)通》指出:“諸黃雖多濕熱,經(jīng)脈久病,不無瘀血阻滯也。”故在辨證論治的基礎(chǔ)上重用涼血活血之品,方中大黃、赤芍、郁金均有活血化瘀之力，合用以助利膽退黃。甘味藥有和、緩之用，本方多用甘味之藥，方中生地、枸杞、甘草、白茅根都為甘味之品，可以緩和藥物毒之毒性，同時(shí)為避免甘味藥過于滋膩“生中滿”，選用砂仁、白術(shù)健脾化濕增強(qiáng)脾胃運(yùn)化之力。全方攻補(bǔ)兼施，共奏補(bǔ)肝體助肝用，清熱解毒祛濕化瘀之用。

Fas和FasL是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一對膜蛋白,兩者結(jié)合后通過結(jié)合胞內(nèi)的死亡受體FADD/MORT1或DAXX，進(jìn)而激活Capase 8[12]或Jnk通路引起表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡。在多種肝病中可發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伴隨著凋亡率的增加，HepG2細(xì)胞中Fas/FasL的表達(dá)增高，提示Fas/FasL活化參與了在異煙肼致HepG2的凋亡過程。解毒護(hù)肝飲藥物血清可以減少異煙肼引起的HepG2壞死和凋亡，同時(shí)減少了Fas/FasL的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制HepG2凋亡作用與其減少Fas/FasL的表達(dá)可能有關(guān)。

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