疏肝補腎法對睡眠剝奪大鼠學習記憶及前額葉皮質BDNF蛋白表達的影響

馮婷 李峰 宋月晗 劉曉蘭 馬捷 毛萌 吳鳳芝 劉晶

睡眠的作用是調節丘腦—皮層以及海馬—新皮質網絡神經元之間同步化作用，可以根據神經元的活動性來促進不同程度的突觸效應，將短時記憶碎片再次激活、分析，并逐漸組合，融合成長時程記憶。不同時間的睡眠剝奪對學習記憶有不同程度的影響，對動物進行中長期睡眠剝奪能顯著造成學習記憶障礙，腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為第二個被發現的神經營養因子也參與長時程增強的產生和維持。本實驗通過疏肝補腎方藥干預睡眠剝奪造成學習記憶障礙，觀察BDNF的蛋白表達，研究疏肝補腎法的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年雄性SD大鼠36只，清潔級，體重(270±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK(京)2006-0009。飼養于室內溫度(22±2)℃、相對濕度在30%～40%的動物房，光照節律12L∶12D(6∶00～18∶00)，適應性飼養3天，期間自由飲水、進食，同時進行站平臺訓練。隨機將大鼠分為3組，每組12只，分別為對照組(正常環境飼養)、模型組(睡眠剝奪)、疏肝補腎治療組(模型組基礎上給予四逆散和生慧湯合方)。

1.2 動物模型制備

采用改良的多平臺(MMPM)睡眠剝奪法[1]復制模型，將模型組和疏肝補腎治療組從造模第1天早8∶00開始放入睡眠剝奪箱，連續7天，至第8天早8∶00結束。使用自制睡眠剝奪箱，規格110 cm(長)×60 cm(寬)×40 cm(高)，塑料箱內壁為灰色，其底面均勻固定15個直徑6.5 cm、高8 cm的有機玻璃平臺。造模開始前在箱內注水，水平面應在平臺下1 cm處，水溫保持在28～30℃。箱頂置鐵絲網，大鼠在平臺間可自由活動和飲食。

1.3 藥物制備與給藥方法

疏肝補腎治療組采用四逆散和生慧湯的1∶1合方。四逆散：選用《傷寒論》的四逆散(由柴胡、枳實、赤芍、炙甘草各6 g組成)；生慧湯：選用《辨證錄·健忘門》的生慧湯(由熟地黃30 g、遠志6 g、山茱萸12 g、柏子仁15 g、菖蒲1.5 g、炒棗仁15 g、茯苓9 g、紅參9 g、白芥子6 g組成)。方藥均為北京中醫藥大學東直門醫院提供的免煎顆粒(北京康仁堂藥業有限公司生產)，按人體用藥量換成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量，每天給予生藥量為13.38 g/kg，灌胃容積1 ml/kg，時間點為睡眠剝奪的4、28、52、76、100、124、148小時。對照組和模型組同時間給予等體積蒸餾水。

1.4 試劑

抗原修復液(北京普利萊基因技術有限公司)，ABC試劑盒(VECTOR公司，美國)，BDNF兔來源多克隆抗體(Abcam公司，美國)，DAB試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.5 學習記憶評定

采用Y迷宮評定大鼠的記憶能力。各組造模前3天進行每天20次的訓練，取第3天成績，造模最后一天再進行測試。設備由三等分迷路箱和控制儀組成。迷路箱為等長的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂和三者的交界區；箱底鋪設間距1 cm的電柵，每臂頂端各裝一盞15 W的刺激信號燈。Y迷宮的控制儀有電壓控制按鈕、延時控制按鈕和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0四個按鈕，當分別按下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按鈕時，相應臂的信號燈亮，此時該臂不通電為安全區，另外無燈光的兩臂及交界區均通電而成為非安全區；按下0按鈕，則三臂均不通電，但交界區通電，信號燈亮后，稍停片刻電柵才開始通電[2]。根據文獻研究，本實驗采用“固定次數隨機不休息法”[3]，實驗時先將大鼠放入迷宮適應3分鐘，然后無規則變換安全區次序，大鼠受電擊后逃到安全區，燈光持續10秒，然后再以所在臂作為下次測試的起始位置進行下一次測試。每個實驗日連續測試20次，連續10次中有9次或者以上正確反應，則為達標。本實驗每組篩選出9只進行測試。所用參數：電壓50～70 V，延時5秒。

1.6 血清SOD檢測

造模結束后，用10%水合氯醛溶液以0.3 ml/100 g體重腹腔麻醉，斷頭取血，置于冰上，使用4℃低溫離心機以3000轉/分離心15分鐘，取得上清置于Eppendorf管中﹐保存于-20℃冰箱待用。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。每組選取9只離心效果好的血清進行檢測。

1.7 前額葉皮質區BDNF蛋白檢測

1.7.1 組織切片 造模結束麻醉后，于冰上取每組半數大鼠的全腦，去除嗅球及小腦后，用液氮迅速冷凍，待腦組織變白置于-80℃冰箱待用。從-80℃冰箱取出組織，在-20℃冰凍切片機內進行組織切片，參考腦部定位圖譜在前額葉皮質區連續切片，厚度為8 μm，貼于載玻片，在混合固定液[4]中固定切片5分鐘后放置于-20℃冰箱待用。

1.7.2 免疫組化檢測 從-20℃冰箱取出冰凍切片，室溫平衡2分鐘，按照說明采用微波熱修復法置于抗原修復液(1∶100)中進行修復，待修復液自然冷卻至室氣溫，將玻片取出，PBS漂洗3分鐘×3次，去離子水沖洗；以0.3% H2O2去除內源性過氧化物酶(室溫、避光、30分鐘)，PBS漂洗5分鐘×3次；羊血清封閉(3∶200、37℃、30分鐘)；傾去多余血清，滴加BDNF兔來源的多克隆一抗(1∶60、4℃過夜)，PBS漂洗5分鐘×3次；滴加二抗(1∶200,37℃，45分鐘)，PBS漂洗5分鐘×3次；滴加A、B液(1∶100，37℃，45分鐘),PBS漂洗5分鐘×3次；DAB顯色(1∶20)，顯色過程中可一邊觀察腦片陽性物質的顯色情況，最后進行上行酒精脫水、二甲苯透明，封片，鏡下觀察、照相，每組隨機抽取3只大鼠，每只大鼠每個部位9個視野，應用NIS-Elements BR 3.1軟件進行圖像分析，結果以平均光密度值表示蛋白表達相對量。

1.8 數據統計

2 結果

2.1 Y迷宮測試結果

Y迷宮結果顯示，造模前最后一次各組間錯誤反應次數和主動回避率基本無差異。造模第7天，從錯誤反應次數顯示，與對照組比較，模型組明顯增多，有非常顯著差異(P<0.01)，疏肝補腎治療組也多于對照組，有顯著差異(P<0.05)；與模型組比較，疏肝補腎治療組的錯誤反應次數明顯減少(P<0.01)。主動回避率結果顯示，與對照組比較，模型組降低，具有非常顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，疏肝補腎治療組增多，差異非常顯著(P<0.01)。說明睡眠剝奪對機體產生明顯的學習記憶力障礙，疏肝補腎方藥可調節學習記憶能力。見表1。

表1 各組大鼠造模第0、7天測試結果

注：與對照組比較，aP<0.01；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.01。

2.2 血清SOD含量

結果顯示，與對照組比較，模型組SOD的含量減少，差異非常顯著(P<0.01)；與模型組比較，疏肝補腎治療組SOD含量明顯增多，差異非常顯著(P<0.01)。說明睡眠剝奪后機體的SOD不能有效的消除應激產生的氧自由基，機體組織細胞損傷明顯加重，而疏肝補腎中藥能顯著增多SOD的含量。見表2。

表2 各組大鼠血清學指標的對比

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01。

2.3 前額葉皮質BDNF蛋白表達變化

在冰凍切片進行免疫組織化學檢測中，BDNF陽性反應物呈圓形、軟圓形或梭形顆粒，染色為棕黃色，分布在胞漿中，所有陰性對照切片均無特異性著色。比較BDNF陽性反應物平均密度值，模型和疏肝補腎治療組與對照組相比明顯減少，具非常顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，疏肝補腎治療組陽性反應物增多，具有非常顯著差異(P<0.01)。說明睡眠剝奪減少BDNF在前額葉皮質的蛋白表達，而疏肝補腎治療組能顯著調節BDNF的減少趨勢。見表3、圖1。

表3 大鼠前額葉皮質BDNF免疫陽性反應物的變化

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖1 各組冰凍切片大鼠前額葉皮質BDNF表達

3 討論

BDNF廣泛存在于腦的各個區域，以大腦皮層和海馬居多。在成年中樞系統，BDNF的表達受一系列因素的調節，也表現為以活動依賴性的方式。它是一個重要的能夠調節突觸可塑性，從而影響學習記憶的中介[5]，BDNF依賴性信號傳導途徑通過活化TrkB受體，使水解磷脂酶C、磷脂酰環己六醇激酶-3、細胞外信號調節激酶、促細胞分裂活性蛋白激酶等的信號通路激活，通過細胞內Ca2+發揮作用，且也調節BDNF、TrkB mRNA的轉化和蛋白向樹突的運輸，這些機制是負責蛋白翻譯并調節突觸傳遞和突觸形成，從而增強和維持學習記憶功能[6]。Mizun等[7]實驗提出BDNF-TrkB信號通路與N-甲基-D-天冬氨酸(NDMA)受體存有內在聯系，這種聯系在海馬空間記憶中起到了重要作用。

實驗結果證明，與對照組比較，模型組Y迷宮成績下降，血清SOD水平降低，前額葉皮質BDNF免疫陽性物質表達顯著減少，說明中長期睡眠剝奪能造成腦損傷，有可能通過BDNF介導的神經通路影響突觸可塑性；經過疏肝補腎方藥的干預，與模型組比較，SOD增多，氧自由基對腦功能損傷的趨勢減弱，Y迷宮學習成績提高，同時BDNF在前額葉皮質的表達上調，說明同時應用疏肝法和補腎法能調節機體的代謝狀態，保護腦功能，并通過誘發長時程增強增強學習記憶能力。在以往的研究中，多采用安神、補腦、補腎、益氣的方法改善睡眠剝奪等應激后所致的學習記憶能力障礙，本研究考慮到，睡眠剝奪作為一種目前生活中常見的應激方式，肝主疏泄功能的影響貫穿整個造模過程中，可以認為是一種主要的影響因素，所以本實驗設計運用疏肝、補腎結合的方法觀察大鼠學習記憶能力的改善。

睡眠剝奪模型模擬的是“想睡而不能睡”的病因病理過程，大鼠在睡眠剝奪箱內雖然可以自由活動、飲食，因受水的刺激，欲逃竄的心理很明顯，在筆者相關試驗中也發現，大鼠在睡眠剝奪期間的攻擊性增強。根據中醫理論，肝主疏泄、調暢氣機，“所欲不得”，氣血運行不暢，諸陽氣會諸于頭，氣機失調則腦失濡養而影響神經相關功能，所以通過疏肝調暢氣機，肝腎同源，又腎主骨生髓，腦為髓海，疏肝的同時予以補腎，則髓海充養，學習記憶功能增強。

針對實驗所復制的造模方法，本研究首先選用《傷寒論》中的四逆散以疏肝郁、調暢氣機，正如《素問·四時刺逆從論》所述“血氣上逆，令人善忘”，陳士鐸在《辨證錄》中所說“氣郁不舒，忽忽如有所失，目前之事竟不記憶，乃肝氣之滯”，并結合具有補腎養心作用的生慧湯，通過肝、心、腎的交互作用，說明睡眠剝奪過程及造成學習記憶障礙的證候。應用疏肝補腎方藥調節大鼠的學習記憶功能，影響BDNF的分布和表達，該通路其他遞質、受體是否也參與對LTP的調節，待后續研究。

參考文獻

[1] Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, et a1. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique：quantification of sleep loss and recovery[J]. Brain Research, 2004, 1004(1-2):45-51.

[2] 王躍春,王子棟,孫黎明,等.動物學習記憶能力的Y-型迷宮測試法[J].暨南大學學報(自然科學與醫學版),2001,22(5):137-140.

[3] 王秀利,唐洪麗,索國玲.癲癇持續狀態對發育期大鼠學習記憶及海馬磷酸化的CAMP反應元件結合蛋白表達的影響[J].實用兒科臨床雜志,2007,22(22):1723-1725.

[4] 邱前程,盧善明,黃杰雄,等.不同固定劑對冰凍切片免疫組化結果的影響[J].分子診斷與治療雜志,2009,1(4):250-252.

[5] Musumeci G, Sciarretta C, Rodríguez-Moreno A, et al. TrkB Modulates Fear Learning and Amygdalar Synaptic Plasticity by Specific Docking Sites[J].J Neurosci,2009,29(32):10131-10143.

[6] Poulin B, Butcher A, McWilliams P, et al. The M3-muscarinic receptor regulates earning and memory in a receptor phosphorylation/arrestin-dependent manner[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(20):9440-9445.

[7] Angelucci F, Mathé AA, Aloe L. Neurotrophic factors and CNS disorders: findings in rodent models of depression and schizophrenia[J].Pro Brain Res,2004,146(3)：151-165.