制備腎臟掃描電鏡樣品的技術方法改良

崔 芳，喬 君，王 一，王 麗*

（1.河北醫科大學電鏡實驗中心，河北石家莊 050017；2.河北醫科大學第一醫院精神科，河北石家莊 050031；3.河北醫科大學第二醫院超聲科，河北石家莊 050000）

·技術方法·

制備腎臟掃描電鏡樣品的技術方法改良

崔 芳1，喬 君2，王 一3，王 麗1*

（1.河北醫科大學電鏡實驗中心，河北石家莊 050017；2.河北醫科大學第一醫院精神科，河北石家莊 050031；3.河北醫科大學第二醫院超聲科，河北石家莊 050000）

腎小球；顯微鏡檢查，電子，掃描；研究技術

腎臟組織的超微結構研究主要集中在腎小球，通常使用透射電鏡經過超薄切片觀察細胞器的二維平面變化［1-3］。隨著研究的深入，愈發需要滿足不同的科研目的及特殊的臨床要求。冷凍割斷技術是一種可以觀察組織細胞內部的掃描電鏡（scanning electronmicroscope，SEM）制樣技術，它充分顯示了內部結構的三維立體形象，具有不可替代的地位，但因有取材要求高、操作流程長、設備裝置多、成本價格高、傷害污染重等不足［4］，限制了廣泛應用。而常規樣品表面制備方法無法準確找到腎小球，即使從切割的部位找到腎小球，往往由于取材切割的擠壓而使結構雜亂無章。為再現腎小球的三維形態，我們將常規制備SEM樣品的技術方法進行改良，既能如冷凍割斷一般，顯示組織細胞內部的三維結構，又具有取材方便易行、操作簡單輕松、樣品易于保存、實驗重復性高等特點，從而為腎臟及與之類似組織的超微結構研究提供新思路。現將此方法具體介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料：動物，雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠3只（河北省實驗動物中心提供），2只成年大鼠體質量在300g左右，1只老年大鼠體質量500g。

1.2 方法

1.2.1 常規SEM樣品制備：10%水合氯醛（0.5mL/100g）腹腔注射麻醉成年大鼠，取右側臥位，腹膜后暴露分離出腎臟組織，預冷的雙面刀片從腎臟皮質部位切取5mm×5mm×5mm的組織塊，放于2.5%戊二醛固定液中固定4h。施以常規表面掃描樣品制備法，乙醇梯度脫水；叔丁醇干燥；IB-3離子噴鍍儀鍍膜；日立S-3500N SEM觀察。

1.2.2 改良SEM樣品制備：動物麻醉成功后快速開胸暴露心臟，將輸液針刺入左心室，同時剪開右心耳，經心-升主動脈先灌注37℃生理鹽水200mL沖凈血液，再灌注4℃含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的磷酸緩沖液（pH 7.4）400mL/只，最初10min快速灌注，后維持1h。后取材固定等操作同常規制樣。

2 結 果

2.1 常規制樣的觀察：低倍鏡下腎小球較清楚，能與周圍的腎小囊及泌尿小管區別出來，但周圍組織結構混亂，大量組織擠壓、移位并覆蓋在表面（圖1）。高倍鏡下可見足細胞胞體和胞體上依次伸出初、次級突起，偶見三級突起（圖2），次級和三級突起朝向血管球基膜（glomrular basement membrane，GBM）的一側呈膨大狀，緊貼在GBM上，而胞體和初級突起則突向腎小囊腔，不直接貼附于GBM上，之間形成的間隙由鄰近的突起伸入，但各級突起間相互連接交叉的關系不清楚（圖3）；相鄰次級突起或細胞自身的次級突起相互穿插鑲嵌形成的柵欄狀結構也發生改變，表現為突起的粗細不均，長短不諧，排列紊亂，突起間隙（即濾過裂隙）也模糊不清；其余結構無法辨認（圖4）。

2.2 改良制樣的觀察：成年大鼠，低倍鏡下腎小球與腎小囊分界清晰，周邊是近端小管等泌尿小管的管腔斷端（圖5）。高倍鏡下可清楚地看到飽滿的足細胞，外形如蜘蛛樣，攀附于毛細血管外周，胞體較大，表面清晰可辨散在的微絨毛（圖6），其伸出的初級突起，進一步發出大量指狀的次級突起，有的次級突起再分出少量三級突起（圖7）；由初級突起垂直伸出系列平行的次級突起，后者又規律性的彼此鑲嵌穿插，呈柵欄樣排列整齊，走形分明，朝向GBM膨大的次級和三級突起，緊貼在GSM上，胞體、初級突起與GBM之間的間隙，由鄰近的突起伸入填充，濾過裂隙也清晰可見（圖8）；在腎小球毛細血管內皮細胞的腔面，可見典型的有孔型內皮（圖9）；在腎小囊壁層為扁平多邊形細胞，細胞核突向腎小囊腔，細胞表面有稀疏散在的微絨毛，各別有單根中央纖毛（圖10）。

老年大鼠，低倍鏡成像能清楚辨認出腎小球及周圍小管的結構。高倍鏡下可見腎小球足細胞胞體及初級突起皺縮、塌陷，有的足突上還有不明贅生物（圖11）；有的次級突起及以下分支腫脹、融合，柵欄狀結構排列紊亂，缺少突起貼附，暴露出GBM，濾過裂隙變窄（圖12）。

圖1 常規制樣的低倍鏡觀察，示腎小球、腎小囊和泌尿小管，但周圍組織結構混亂，大量組織殘渣覆蓋在表面（×1 500）圖2 常規制樣的高倍鏡觀察，示足細胞胞體，表面覆有組織殘渣，影響觀察（×6 000）圖3 常規制樣的高倍鏡觀察，足細胞胞體及其伸出的各級突起，但各級突起間相互連接交叉的關系不很清楚圖4 常規制樣的高倍鏡觀察，各級突起都粗細不均，長短不諧，排列紊亂（×18 000）圖5 改良的成年大鼠低倍鏡觀察，腎小球與腎小囊分界清晰，周邊是近端小管等泌尿小管的管腔斷端（×1 000）圖6 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，示飽滿的蜘蛛樣足細胞，攀附于毛細血管外周，胞體表面有散在的微絨毛（↑示）（×5 000）圖7 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，足細胞胞體伸出初級、次級和三級突起（×10 000）圖8 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，柵欄狀結構排列整齊，走形分明，濾過裂隙清晰（×20 000）圖9 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，示典型的有孔型毛細血管內皮細胞腔面（×20 000）圖10 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，扁平多邊形的腎小囊壁層細胞，細胞核突向腎小囊腔，細胞表面有稀疏散在的微絨毛，各別有單根中央纖毛（↑示）（×3 000）圖11 改良的老年大鼠高倍鏡觀察，足細胞胞體及初級突起皺縮、塌陷，各級突起上有不明贅生物（↑示）（×10 000）圖12 改良的老年大鼠高倍鏡觀察，次級突起及以下分支腫脹、融合，柵欄狀結構排列紊亂，缺少突起貼附，暴露出GBM（×10 000）

3 討 論

通過上述對比觀察可以看出常規SEM樣品制備的腎臟組織，雖然能看到腎小球大體結構，但具體形態及與周圍組織間的相互關系并不十分清晰，造成這一現象的主要原因在于樣品切割取材后放入固定液，必然導致結構受擠及生活狀態超微結構的改變。而經過技術改良的腎臟組織，先經心臟進行全身灌流固定，使其保持了良好的生活狀態超微結構，所以在觀察時可以非常清楚全面地辨別出腎小球、腎小管的形態及足突走向，甚至還可以觀察到腎小球的有孔型毛細血管內皮細胞等結構，而這些結構在常規制樣的腎臟中均未見到；在一些生理或病理情況下，如肥胖老年大鼠，腎小球足突發生的結構改變，也很清晰直觀地表現出來，改變了以往只能用冷凍割斷技術觀察腎臟組織內部立體結構的觀點［5］，為之提供新的思路；而且對于異地取材，技術改良使樣品易于保存，不再受時間限制，加之制樣時間縮短，操作簡便，使SEM能以三維立體直觀形象的成像視角更好地表現了不同于透射電鏡的圖像，為廣大腎病研究者提供更有效的技術方法。擴展開來也可進一步廣泛應用于其他與之類似的組織觀察。

［1］ GARROSA M，LLANES F，GAYOSO MJ.Histopathological changes in gerbil liver and kidney after aluminum subchronic intoxication［J］.Histol Histopathol，2011，26（7）：883-892.

［2］ ZENG W，CHENG AC，CHEN ZL，et al.In vivo assessment of mitochondrial toxicity ofmetacavir in Rhesus monkeys after three months of intravenous administration［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30（12）：1666-1673.

［3］ YUAN LY，ZHANG HQ，XU DL.Protective effect of tongxinluo superflnes on anglotensinⅡcaused renal injury in rat［J］. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2009，29（12）：1104-1109.

［4］ 應國華.電鏡技術與細胞超微結構［M］.香港：現代出版社，1993：59-79.

［5］ 葉達夫，張杰，姚頤.大鼠急、慢性梗阻性積水腎組織的形態學改變［J］.武漢大學學報：醫學版，2010，31（2）：166-169.

（本文編輯：劉斯靜）

R322-34

B

1007-3205（2012）03-0357-03

2011-10-13；

2011-11-01

崔芳（1980-），女，河北正定人，河北醫科大學電鏡實驗中心助理實驗師，從事電子顯微學研究。

*通訊作者。E-mail：wl601021@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.047