SET8基因3’端非翻譯區的m iR-502結合位點單核苷酸多態性與肝癌患者預后的關系

李進軍，張瑞星，楊 華，張風賓，郭占軍*

（1.河北醫科大學第四醫院醫療保險辦公室，河北石家莊 050011；

2.河北醫科大學第四醫院消化內科，河北石家莊 050011））

·論 著·

SET8基因3’端非翻譯區的m iR-502結合位點單核苷酸多態性與肝癌患者預后的關系

李進軍1，張瑞星2，楊 華2，張風賓2，郭占軍2*

（1.河北醫科大學第四醫院醫療保險辦公室，河北石家莊 050011；

2.河北醫科大學第四醫院消化內科，河北石家莊 050011））

目的研究SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性與肝癌患者預后的關系。方法在河北醫科大學第四醫院完成肝癌患者80例SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性測序分析，生存曲線分析采用Kaplan-Meier方法，組間對比使用Log-rank檢驗，使用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。結果研究發現肝癌患者SET8基因3’端非翻譯區種子區域miR-502結合部位一個多態位點rs16917496 CC基因型患者生存時間較長，差異有統計學意義（相對危險度0.187，95%可信區間0.073～0.757，P= 0.005）。結論SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性是肝癌患者預后的一種獨立危險因素。

肝腫瘤；RNA；預后；多態性，單核苷酸

肝癌是第4大常見惡性腫瘤，每年大約有50萬患者死亡，病死率居世界第3位，肝癌的惡性程度和缺乏有效的治療手段困擾著研究人員，肝癌的發生與多種風險因素有關，包括慢性乙型肝炎病毒，慢性丙型肝炎病毒和酒精損害等［1］。在亞洲和非洲，慢性乙型和丙型肝炎病毒流行高于其他大洲，因此肝癌的發生率在這2個大洲持續升高，在中國慢性乙型肝炎病毒感染是一個具有挑戰的健康問題，大約9 000萬人是病毒攜帶者，其中3000萬人已經出現慢性肝臟損害。同時在中國酒精性肝病患者也持續增加，人口統計發現6.6%男性和0.1%女性被診斷為酒精依賴，很多人將發展為肝病，而酒精性肝病和肝硬化更容易進展為肝癌［2］。盡管臨床診斷和治療有了長足發展，但肝癌復發機會仍很高，預后差。到目前為止肝癌致病的機制仍不明確，本研究探討SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性與肝癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2003年9月—2008年7月河北醫科大學第四醫院肝膽外科手術患者80例，其中男性66例，女性14例，年齡23～70歲，平均58.4歲，包括乙型肝炎相關性肝癌患者56例，酒精性肝癌患者10例，丙型肝炎相關性肝癌患者14例。患者術后每3個月隨訪1次，共隨訪3年，所有患者術后未接受化療或放療，術前均空腹抽取外周靜脈血，外周血標本當天提取DNA后置于-80℃恒溫冰箱保存。

1.2 研究方法：PCR擴增DNA和序列分析，正向和反向引物，5-TCACGACGGTGCTACCTAAG-3，5-CATGCTGGTGTGACACAGTC-3，依據NCBI數據庫擴增SET8基因3’非編碼區rs16917496目的片段基因。使用PCR預混試劑盒進行擴增，PCR產物純化后測序，測序試劑為BigDye terminator v3.1，測序儀器為ABIPRISM31000XL DNA序列分析儀，同一標本采用雙向重復測序。

1.3 統計學方法：應用SPSS11.5統計學軟件進行分析，生存曲線分析采用Kaplan-Meier方法，組間對比使用Log-rank檢驗，使用Cox風險回歸模型進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

本研究共收集患者80例，患者的臨床特征和3年生存期分析使用Kaplan-Meier方法，采用Logrank檢驗。研究發現患者的性別和年齡與術后生存時間無關，而腫瘤大小、腫瘤數量、Child分級和有無門脈瘤栓與生存時間有關，結果見表1。不同臨床分期患者有相應地生存率，Ⅰ～Ⅱ期患者生存率為46.3%，Ⅲ期患者生存率為0.0%，不同的分期其生存時間有明顯差別，經Log-rank檢驗差異有統計學意義（P＜0.01）；有無門脈瘤栓和Child分級與患者總的生存時間有關（P＜0.01，P＜0.05）；同時發現腫瘤＞5cm和≤5cm比較，單個腫瘤和多個腫瘤比較時，生存時間有明顯差異（P＜0.01，P＜0.05）。這些研究發現表明臨床分期、有無門脈瘤栓、腫瘤大小、Child分級和腫瘤數量與肝癌患者的預后有關。

表1 肝癌患者的臨床特征與術后生存期的關系Table 1 Correlation between clinical characteristics and post-operative survival in HCC patients

本研究對80例肝癌患者多態位點rs16917496的單核苷酸多態性進行測序分析，發現肝癌患者SET8CC、CT和TT基因型頻率分別為11、50和72，rs16917496位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。隨后我們分析了rs16917496位點多態性和肝癌患者術后生存時間的關系。根據rs16917496位點基因型，肝癌患者被分為3組，術后生存曲線分析采用Kaplan-Meier法。CC、CT、TT 3種基因型患者3年生存率分別為50.0%、39.3%和40.1%，研究發現生存率有明顯差異，C/C等位基因型患者相對于C/T和T/T基因型患者生存時間明顯延長，差異有統計學意義（CC與CT比較，P= 0.007；CC與TT比較，P=0.011）（圖1～2）。CT與TT基因型相比生存時間差異無統計學意義，這些數據表明CC基因型與肝癌患者生存時間長和預后好相關。

圖1 SET8基因CC與TT基因型患者生存期比較Figure 1 Comparison of survival time between the patients with C/C allele and thosewith T/T allele

我們使用Cox比例風險回歸模型分析了臨床分期、門脈瘤栓、Child分級、腫瘤大小和腫瘤數量這些預測因子，研究證實rs16917496位點單核苷酸多態位點可作為肝癌患者預后的獨立預測因素（相對危險度0.187，95%CI 0.073～0.757，P=0.005）。臨床分期、門脈瘤栓、腫瘤大小、Child分級也可以作為肝癌患者預后的獨立的預測因子。這些數據均表明SET8基因rs16917496單核苷酸多態性可作為肝癌患者的預后指標。見表2。

圖2 SET8基因CC與CT基因型患者生存期比較Figure 2 Comparison of survival time between the patients with C/C allele and thosewith C/T allele

表2 肝癌患者Cox比例風險回歸模型多因素分析Table 2 M ultivariate analysis of prognostic factors associated w ith post-operative survival in HCC patientswith Cox proportional hazardsmodel

3 討 論

miRNAs是長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA分子，通過與靶mRNA的互補配對在轉錄后水平上對基因表達進行調控，導致mRNA降解或翻譯抑制。miRNAs在許多生物調節過程中起了重要作用，如細胞生長和凋亡、腫瘤的發生、胰島素分泌等［3-4］。在人體中發現超過700種miRNAs，這些miRNAs參與了至少30%蛋白質編碼基因的調節［5］。越來越多的研究發現miRNAs和端3’非翻譯區單核苷酸多態位點結合后導致靶基因表達改變，進而導致腫瘤的發生［6］。在基因研究方面，盡管miRNA結合位點多態性近來被廣泛研究，但miRNA結合位點多態性與腫瘤預后關系的研究甚少。

SET8基因編碼組蛋白H4賴氨酸20單甲基轉移酶，與正常細胞周期有關。SET8mRNA 3’端非編碼區有miR-502的結合位點，miR-502與其結合后調節基因的表達，單核苷酸多態位點rs16917496位于SET8基因3’端非編碼區miR-502的結合區域內，以往研究發現該位點與SET8基因表達的調節有關，與腫瘤的早期發生有關［7］。

本研究發現SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性可作為肝癌患者預后的指標，該位點單核苷酸多態性與SET8基因的表達的調節有關，基因表達的改變可能通過某種隱性方式影響了肝癌患者的生存時間。本研究首次報道了SET8基因單核苷酸多態性可能是肝癌的一種病因。由于研究的單核苷酸多態位點位于SET8基因3’非編碼區與miR-502結合的種子區域，miR-502和SET8基因3’非編碼區結合部位rs16917496位點T突變為C改變了原有的G∶C結合，進而影響了SET8基因的表達。我們的研究發現SET8基因表達的改變影響了肝癌患者的預后，而SET8基因表達的調節至少部分與miR-502結合有關。Song等［7］也研究發現SET8基因CC型與RNA表達水平低有關，我們的研究同樣發現CC基因型與RNA的低表達有關，肝癌患者CC基因型生存時間長。

多因素分析表明SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性是肝癌預后一種獨立因素，與所有miRNAs單核苷酸多態性位點一樣，我們所研究的位點單核苷酸多態性也是疾病發生的關鍵因素［8］。以往研究發現這些單核苷酸多態性與腫瘤的發生有關，是致癌風險因素。

SET8作為一種甲基轉移酶，通過與p53基因序列結合的組蛋白382賴氨酸甲基化，進而影響p53基因的表達，改變它的轉錄活性。SET8的缺失促進了p53的凋亡，影響了它的作用。p53甲基化影響SET8基因的表達與肝癌患者生存率之間的關系需要進一步研究。以往研究發現SET8基因剔除后可以抑制p53的生物活性，進而加速了細胞壞死過程［9］。

Yu等［10］采用病例對照研究發現12個miRNA結合位點單核苷酸多態位點在多種腫瘤中顯示出異常的等位基因頻率，已經證實SET8基因miR-502結合位點是其中之一。我們研究了該位點單核苷酸多態性在正常對照組中的頻率分布，發現差異無統計學意義，但不排除該位點單核苷酸多態性在不同腫瘤中具有不同的作用。

盡管對miRNAs結合位點單核苷酸多態位點的研究處于早期階段，以往研究發現miRNAs是影響包括腫瘤在內的其他疑難疾病治療效果的一種關鍵因素［11］。本研究發現miRNAs等位基因單核苷酸多態位點與腫瘤的發生和預后有關，這是令人鼓舞的。

總之，本研究發現SET8基因3’端非翻譯區的miR-502結合位點單核苷酸多態性是肝癌預后的一種獨立危險因素，這一發現將有助于劃分肝癌患者預后好壞的分組，并有助于肝癌患者治療方案的選擇。

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（本文編輯：劉斯靜）

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《河北醫科大學學報》編輯部

ASSOCIATION OF POLYMORPHISM AT THE m iR-502 BINDING SITE IN THE 3’UNTRANSLATED REGION OF THE HISTONE METHYLTRANSFERASE
SET8 W ITH HEPATOCELLULAR CARCINOMA OUTCOM E

LI Jinjun1，ZHANG Ruixing2，YANG Hua2，ZHANG Fengbin2，GUO Zhanjun2*
（1.Medical Insurance Office，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；
2.Departmentof Gastroenterology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the association of polymorphism at themiR-502 binding site in the 3’untranslated region（UTR）of the histone methyltransferase SET8 with hepato cellular carcinoma outcome.MethodsThe region of single nucleotide polymorphism（SNP）in the miR-502 binding site of the SET8 3’UTR was sequenced for 80 hepatocellular carcinoma patients recorded in the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Survival curves were calculated using the Kaplan-Meier method，and comparisons between the curves weremade using the Log-rank test.Multivariate survival analysiswas performed using a Cox proportional hazardsmodel.ResultsSingle nucleotide polymorphism（rs16917496）within the miR-502 microRNA seed region for the 3’UTR of SET8 in Chinese HCC patients was found.The SET8 CC genotype was independently associated with longer post-operative survival in HCC patients by multivariate analysis（relative risk，0.187；95%CI，0.073-0.757；P= 0.005）.ConclusionSNP in the miR502 binding site of the SET8 3’UTR was found to be an independent prognostic marker for HCC outcome.

liver neoplasms；RNA；prognosis；polymorphism，single nucleotide

R735.7

A

1007-3205（2012）03-0252-04

2011-11-17；

2012-02-18

李進軍（1970-），男，河北寧晉人，河北醫科大學第四醫院主治醫師，醫學學士，從事腫瘤防治管理工作。

*通訊作者。E-mail：zjguo5886@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.003