中藥筋脈通對高糖培養海馬神經元細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響①

郭蕾蕾，張宏，田國慶，梁曉春

中藥筋脈通對高糖培養海馬神經元細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響①

郭蕾蕾1a，張宏1b，田國慶1a，梁曉春1a

目的探討中藥筋脈通含藥血清對高糖培養海馬神經元細胞的保護作用。方法采用血清藥理學方法制備筋脈通含藥血清(JMT)，原代培養新生鼠海馬神經元細胞分別接種于不同條件的培養基中，分為正常對照組、高糖組、陽性對照組以及JMT大、中、小劑量組。不同培養基中培養72 h后使用Western blotting檢測其Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。結果與正常對照組相比，高糖組Caspase-3、Bax表達明顯增加(P＜0.01)，Bcl-2的表達下降(P＜0.05)；與高糖組相比，陽性對照組和JMT各劑量組的Caspase-3、Bax表達明顯下降(P＜0.01)，Bcl-2的表達升高(P＜0.05)；與陽性對照組相比，JMT各劑量組的Caspase-3、Bax表達下降(P＜0.05)，筋脈通大、中劑量組Bcl-2的表達增加(P＜0.05)。結論筋脈通含藥血清可能通過提高Bcl-2蛋白的表達，減少Bax、Caspase-3的表達，上調Bcl-2/Bax的比值，從而減少海馬神經元細胞的凋亡。

糖尿?。徽J知功能障礙；筋脈通；海馬神經元；Bax；Bcl-2；Caspase-3

[本文著錄格式]郭蕾蕾，張宏，田國慶，等.中藥筋脈通對高糖培養海馬神經元細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(4):324-328.

隨著糖尿病發病率的逐年增加，糖尿病導致的學習記憶功能障礙日益受到人們的重視。一方面，糖尿病可明顯增加癡呆的發生風險，包括血管性癡呆(vascular dementia,VD)和阿爾茨海默病(A lzheimer's Disease,AD)；另一方面，糖尿病可以導致患者輕、中度認知功能的下降，表現為輕、中度學習、記憶和執行能力的下降[1]。多種因素參與糖尿病認知功能下降的復雜病理過程，其中高血糖對腦神經元的影響是不可忽略的重要因素[2]，而與學習記憶活動關系密切的海馬更容易受到血糖水平的影響[3]。中藥筋脈通膠囊是北京協和醫院的內部制劑，長期應用于臨床，對糖尿病及其周圍神經病變等慢性并發癥具有較好的療效[4]。本實驗以原代培養海馬神經元細胞為靶細胞，觀察筋脈通含藥血清對高糖環境下海馬神經元相關凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響，以期探討中藥筋脈通對高糖培養海馬神經元細胞的保護作用。

1 材料

1.1 動物 出生24 h SD新生鼠15只，體重約4～6 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-2007。SD雄性大鼠38只，體重280～320 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可號：SCXK(京)2007-0001。

1.2主要試劑與藥品 DMEM高糖培養基(北京協和細胞資源中心)；優質胎牛血清(characterized fetalbovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA(Hyclone)；多聚左旋賴氨酸(polylysine,PLL)(SIGMA)；神經元生長因子(nerve grow th factor,NGF)(Invirtogen)；FITC標記山羊抗兔IgG(中杉金橋)；兔抗鼠Enolase(NSE)、activated Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗體(Bioworld)；HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson)；兔抗鼠β-actin多克隆抗體(Santa cruz)；Caspase抑 制劑 Z-VAD-FMK(碧 云 天)； 即 用 型 Annexin-V-FLUOS試劑盒(Roche)；PVDF膜，0.45μm孔徑(M illipore)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；SDS (SIGMA)；ECL發光液(M illipore)；筋脈通膠囊(由菟絲子、女貞子、水蛭、延胡索、桂枝、細辛等組成)，中國醫學科學院北京協和醫院院內制劑，由北京九龍制藥廠加工生產，每粒含生藥0.35 g，批準文號(97)京衛藥制加字[48]第F-292號，生產批號：061019。

1.3主要儀器與設備 ALC PK 121R高速低溫離心機；Thermo Fresco低溫冷凍離心機；Forma 3111 CO2培養箱；Olympus CKX31SF倒置相差顯微鏡；Leica TCSSP2SE激光掃描共聚焦顯微鏡；M illipore Advantage A 10超純水系統；Thermo M ultiSkanMK 3酶標儀；Cavoy M iniP-4電泳槽；Cavoy濕轉電泳槽；Bio-Rad電泳儀。

2 方法

2.1含藥血清及正常大鼠血清的制備 SPF級雄性SD大鼠38只，根據隨機數字表法分為正常組(n=28)和筋脈通組(n=10)。適應性喂養24 h后開始灌胃。筋脈通組按成人劑量的15倍給藥(即1.3125 g/kg?d)，正常組給予同等體積的蒸餾水。每天灌胃2次，連續3 d。于末次灌胃后2 h內頸動脈取血，采集的全血室溫靜置2 h后，4℃ 4000 r/m in離心10 m in，分離血清，置-20℃冰箱保存備用，避免反復凍融。使用時56℃水浴滅活30m in，0.22μm濾器過濾，用正常大鼠血清分別按0∶1、1∶2、2∶1的比例稀釋筋脈通含藥血清即得筋脈通大、中、小劑量含藥血清。

2.2細胞培養液的配制 DMEM完全培養基：180m l DMEM高糖培養基中分別加入FBS(終濃度10%)、谷氨酰胺(2 mmol/L)，丙酮酸鈉(1 mmol/L)，Hepes(20 mmol/L)，雙抗(青霉素100 U/m l，鏈霉素100μg/ m l)，NGF(10 ng/m l)。置4℃冰箱保存備用。

DMEM無血清培養基：除不加FBS外，余與DMEM完全培養基的配制相同。

2.3實驗分組 使用DMEM完全培養基培養細胞至第3天時，更換為不同條件的培養基。各組培養基均含DMEM無血清培養基，其中正常對照組(NC)另加10%正常血清，其余各組均加50mmol/L葡萄糖，高糖組(HG)另加10%正常大鼠血清，陽性對照組(PC)另加10%正常血清和10mmol/m l Z-VAD-FMK，JMT大劑量組(JH)、中劑量組(JM)、小劑量組(JL)分別另加入10%筋脈通大、中、小劑量含藥血清。

2.4海馬神經元的分離、純化與培養 出生24 h SD新生鼠，75%酒精浸泡5 m in，取出后置-20℃約3～5 m in，分離腦內兩側海馬組織；用D-Hank's液沖洗2次后將組織剪碎至0.5～1.0mm，加入濃度為0.25%胰蛋白酶37℃消化約20m in；觀察液體呈一定懸濁度即加入FBS終止消化，用200目細胞篩過篩，收集細胞懸液；將細胞懸液小心加入15m l離心管中淋巴細胞分離液(與細胞懸液的比例1∶1.6)的上層，2000 r/m in離心20m in，收集細胞層細胞；用D-Hank's液重懸細胞，1500 r/m in再次離心5 m in；棄上清，用DMEM完全培養基30m l重懸細胞，細胞計數后按一定的細胞密度接種于PLL包被的培養瓶或培養板中。

2.5海馬神經元的鑒定 將細胞懸液以5×105細胞/孔的濃度接種到預先放置了蓋玻片的6孔培養板中，培養至第3天取出蓋玻片進行免疫熒光鑒定，共聚焦激光顯微鏡檢測NSE的表達，檢測步驟如下：①取出蓋玻片，0.01M PBS浸洗后加入4℃預冷的4%多聚甲醛常溫固定1 h；②0.01M PBS漂洗3次×2m in，加入0.1% Triton-X 100浸泡10 m in；③0.01 M PBS清洗3次×2 m in，加入山羊血清封閉液與非特異性蛋白結合，室溫孵育20m in；④加入一抗即兔抗鼠NSE多克隆抗體(1∶10)，濕盒內37℃孵育1 h，陰性對照組以0.01M PBS代替一抗；⑤0.01 M PBS清洗3次×2m in，加入FITC偶聯山羊抗兔IgG(1∶50)，37℃濕盒避光孵育1 h；⑥0.01 M PBS振洗6次×5m in，加入DAPI工作液封片；⑦使用共聚焦激光顯微鏡進行檢測，所攝圖像以Leica Confocal圖像分析軟件分析，每組計數15～20個細胞。

2.6Western blotting檢測Bcl-2、Bax、Caspase蛋白表達 ①蛋白樣品的制備：待檢測的各組細胞樣本加入預冷RIPA裂解液，冰上孵育20 m in，13000 r/m in，4℃離心，20m in，取上清；按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的使用方法，計算出各組蛋白濃度；補充RIPA調整各組蛋白濃度。②SDS-PAGE電泳：根據目的蛋白的分子量，制備10%分離膠和5%濃縮膠；蛋白樣品中加入等量2×SDS-PAGE加樣緩沖液，于100℃加熱5m in使蛋白充分變性；冷卻樣品后，按順序將處理好的樣品加入濃縮膠加樣孔內，樣品15μl/孔，marker 3μl/孔，以SDS-PAGE電泳進行蛋白分離。③轉膜：使用濕轉法將分離膠上的蛋白轉移到PVDF膜上；麗春紅染色觀察轉膜效果；對照marker，剪出膜上的目的蛋白及內參蛋白β-actin的條帶。④封閉：將膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，搖床上室溫封閉30 m in，TBST洗膜。⑤一抗孵育：分別加入1∶1000稀釋的一抗即兔抗鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗體，搖床上室溫輕搖40m in后，4℃孵育過夜。⑥二抗孵育：TBST漂洗膜后，加入1∶1000稀釋的二抗即HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)，搖床室溫孵育40 m in，TBST漂洗。⑦蛋白檢測：將ECL發光液加到膜上后反應3～5 m in，膠片曝光10 s～5 m in，顯影2 m in，定影，所攝圖像以LabWorks 4.6圖像分析軟件分析，記錄各組目的蛋白及內參蛋白的灰度掃描值，每組重復3次。

2.7統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件包進行分析，所有數據采用(±s)描述，行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性水平α=0.05。

3 結果

3.1海馬神經元形態 倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的海馬神經元胞體呈圓形，體積小，折光性強，分布均勻；培養1 d后，大部分細胞伸出三四個短小的突起，其中有些細胞發生再聚合現象，細胞幾乎全部貼壁；生長4 d后，神經元細胞體進一步增大，突起進一步增多并明顯增長，連接形成稀疏的網絡，神經元以多極神經元為主；培養7 d后，細胞體積繼續增大，胞體飽滿，突起增粗增長，分支增多，形成致密的網絡。見圖1。

圖1 培養海馬神經元細胞的形態

3.2海馬神經元鑒定及純度 培養3 d的細胞，NSE免疫熒光染色，胞漿和突起被染成綠色而胞核不被染色的為陽性細胞，所有細胞的胞核均被染成藍色。見圖2。

在共聚焦激光掃描顯微鏡下進行觀察并拍照，以3個視野中陽性神經元的數目占總細胞的比例為神經元純度，經鑒定神經元純度達90%以上。

3.3Western blotting檢測各組Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達 各組內參蛋白β-actin的表達無顯著性差異(P＞0.05)；與NC組相比，HG組Caspase-3、Bax表達明顯增加(P＜0.01)，Bcl-2的表達下降(P＜0.05)，Bcl-2/ Bax的比值下降(P＜0.05)；與HG組相比，PC組和筋脈通各劑量組的Caspase-3、Bax表達均明顯下降(P＜ 0.01)，Bcl-2的表達升高(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.05)；與PC組相比，筋脈通各劑量組的Caspase-3、Bax表達下降(P＜0.05)，JH和JM組Bcl-2的表達增加(P＜0.05)，JL組Bcl-2的表達與PC組無顯著性差異(P＞0.05)；筋脈通各劑量組之間相比，JH、JM、JL三組Caspase-3表達均具有顯著性差異(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值在三組間呈下降趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。各組內參蛋白β-actin與目的蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的灰度掃描值以及Bcl-2/Bax的比值見表1。

各組Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin的Western blotting化學發光免疫印跡見圖3。

表1 Western b lotting檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax的表達

圖2 培養的海馬神經元(NSE免疫熒光染色，200×)

圖3 各組Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin Western blotting

4 討論

海馬組織是中樞神經系統維持完整的學習和記憶功能的重要結構，對血糖代謝平衡的變化尤其敏感?；谙袼氐男螒B學測量(voxel-based morphometry, VBM)分析腦磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)顯示，糖尿病可導致海馬體積的明顯萎縮[5-7]。同時海馬組織也是糖尿病患者大腦最先受累的結構，海馬相關的記憶(近期或陳述性)缺陷也是最先受損的認知功能[6-7]。由于腦MRI所反應海馬體積與實際神經元數量的體積是等價的[8]，因此，MRI示海馬體積的下降顯示了海馬神經元的丟失。另外，研究發現海馬體積的萎縮程度與糖化血紅蛋白、糖尿病病程呈正相關，血糖控制不良的患者海馬體積下降更明顯[6,9-10]。動物實驗發現，持續性高血糖可引起海馬區神經元的凋亡，導致神經元密度下降[11-12]?？梢酝茢?，高血糖引起的海馬神經元凋亡必然參與了糖尿病認知功能障礙的發生發展過程。

目前糖尿病認知功能障礙的發病機制并不明確，一般認為，高血糖引起的大腦缺血改變、氧化應激、非酶性蛋白糖基化、鈣離子穩態的改變等是其中不可忽略的重要因素[13]。K lein和Waxman詳細分析了糖尿病時神經元的分子改變，認為以上因素雖然可造成神經元的損傷，神經元基因表達的改變可能是糖尿病認知功能障礙新的發病機制[14]。細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序性死亡，涉及一系列基因激活、表達以及調控等主動過程。其中，Caspase被認為是一切凋亡信號轉導的共同通路，Caspase-3是凋亡的主要執行者，是Caspase級聯反應中關鍵的效應蛋白酶，一旦被激活，凋亡常難以避免[15]。Bcl-2家族在凋亡細胞內信號傳導中起著重要作用，抗凋亡Bcl-2與促進凋亡的Bax具有高度同源性，可形成異源二聚體，兩者之間比例的平衡可決定凋亡是否發生[16]。目前認為，Bax和Bcl-2蛋白可通過抑制細胞色素C的釋放和Caspase的激活來調節細胞凋亡的發生。

本實驗檢測高糖環境下海馬神經元細胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達，發現HG組較NC組Caspase-3、Bax的表達明顯增加，而Bcl-2的表達下降，導致Bcl-2/Bax比值下降。說明高糖可通過調節Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達，從而促進海馬神經元的凋亡。此結果與Stranahan、Norman等[11-12]的研究結果類似?？梢酝茢啵咛强赡苁峭ㄟ^降低Bcl-2/Bax的比值達到一定“閾值”后，充分激活Caspase級聯反應，最終促進神經細胞凋亡的發生。Caspase抑制劑Z-VAD-FMK是一種可以穿過細胞膜的泛Caspase抑制劑，可以抑制Caspase激活導致的細胞凋亡[17]。本實驗使用Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK的陽性對照組和筋脈通各劑量組中Caspase-3、Bax的表達較高糖組明顯下降，并且Bcl-2的表達升高，Bcl-2/Bax的比值升高，且筋脈通各劑量組對凋亡相關蛋白的調節作用顯著優于陽性對照組并且呈一定濃度依賴性趨勢。提示Caspase-3抑制劑和筋脈通含藥血清對高糖環境下海馬神經細胞凋亡的抑制作用可能是通過提高Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的激活實現的；并且筋脈通含藥血清對凋亡蛋白的調節作用優于Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK。

糖尿病認知功能障礙屬于中醫消渴病合并“呆癥”、“健忘”的范疇，《圣濟總錄》中有“消渴日久，健忘怔忡”等認知功能損害的癥狀記載?！夺t學心悟》中有“腎主智，腎虛則智不足”之說，因此學習記憶障礙患者多有腎虛。另外，現代研究證實糖尿病患者多有血瘀[18]。故消渴呆癥的基本病機為腎虛血瘀，絡脈不通。因此，補腎活血通絡是治療糖尿病性認知功能障礙的根本大法。筋脈通主要由菟絲子、女貞子、水蛭、延胡索、桂枝、細辛等組成。菟絲子、女貞子歸肝、腎經，兩者配伍滋陰益腎，陰陽俱補；水蛭歸肝經，具破血逐瘀之功，與女貞子、菟絲子配伍使得補腎與活血并行，祛邪而不傷正；延胡索性溫，主要作用是活血化瘀、行氣止痛，與水蛭同用加強活血化瘀的功效；桂枝、細心皆入肺、腎、心經，溫陽通絡，諸方共奏補腎養陰活血通絡之效，符合糖尿病認知功能障礙的病機。同時，筋脈通組方中的齊墩果酸、香豆素、水蛭素、桂皮醛、細辛醚、黃酮類、苷類、生物堿類等單體或有效成分具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。由此推斷，筋脈通對高糖培養海馬神經元凋亡可能具有一定的保護作用。至于筋脈通在體內環境下的作用及其確切機制尚有待于進一步的研究和探討。

致謝

感謝中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所劉玉琴教授對本論文寫作上的幫助。

[1]Pasquier F,Boulogne A,Leys D,et al.Diabetesmellitus and dementia[J].DiabetesMetab,2006,32(5):403-414.

[2]Kodl CT,Seaquist ER.Cognitive dysfunction and diabetesmellitus[J].Endocr Rev,2008,29(4):494-511.

[3]Li ZG,Zhang W,Grunberger G,et al.Hippocampal neuronal apoptosis in type 1 diabetes[J].Brain Res,2002,946(2): 221-231.

[4]梁曉春,崔麗英,郭賽珊,等.筋脈通治療糖尿病周圍神經病變的臨床觀察[J].中國中西醫結合雜志,1999,19(9):517-519.

[5]Kam iyama K,Wada A,Sugihara M,et al.Potential hippocampal region atrophy in diabetes mellitus type 2:a voxel-based morphometry VSRAD study[J].Jpn J Radiol,2010,28(4): 266-272.

[6]Gold SM,Dziobek I,Sweat V,et al.Hippocam pal damage and memory impairments as possible early brain complications of type 2 diabetes[J].Diabetologia,2007,50(4):711-719.

[7]Bruehl H,Wolf OT,Sweat V,etal.Modifiers of cognitive function and brain structure in m iddle-aged and elderly individuals w ith type 2 diabetes mellitus[J].Brain Res,2009,1280: 186-194.

[8]BobinskiM,de Leon M J,Wegiel J,etal.The histological validation of postmortem magnetic resonance imaging-determ ined hippocam pal volume in A lzheimer's disease[J].Neuroscience, 2000,95(3):721-725.

[9]Korf ES,W hite LR,Scheltens P,et al.Brain aging in very old men w ith type 2 diabetes:the Honolulu-Asia aging study[J]. Diabetes Care,2006,29(10):2268-2274.

[10]den Heijer T,Vermeer SE,van Dijk EJ,et al.Type 2 diabetes and atrophy of medial temporal lobe structures on brain MRI[J].Diabetologia,2003,46(12):1604-1610.

[11]Stranahan AM,A rumugam TV,Cutler RG,et al.Diabetes impairs hippocampal function through glucocorticoid-mediated effects on new and mature neurons[J].Nature Neurosci,2008, 11(3):309-317.

[12]Stranahan AM,Norman ED,Lee K,et al.Diet-induced insulin resistance impairs hippocampal synaptic plasticity and cognition in m iddle-aged rats[J].Hippocampus,2008,18(11): 1085-1088.

[13]徐敏,楊紅英.氧化應激與糖尿病腦病[J].國際檢驗醫學雜志,2008,29(8):729-730.

[14]K lein JP,Waxman SG.The brain in diabetes:molecular changes in neurons and their implications for end-organ damage[J]. LancetNeurol,2003,2(9):548-554.

[15]Thornberry NA,Lazebnik Y.Caspases:enem ies w ithin[J]. Science,1998,281(5381):1312-1316.

[16]Takahashi A,Masuda A,Sun M,et al.Oxidative stress-induced apoptosis is associated w ith alterations in m itochondrial Caspase activity and Bcl-2-dependent alterations in m itochondrial pH(pHm)[J].Brain Res Bull,2004,62(6):497-504.

[17]Deng T,Zhang Y.Possible involvement of activation of P53/ P21 and demethylation of RUNX 3 in the cytotoxicity against Lovo cells induced by 5-Aza-2'-deoxycytidine[J].Life Sci, 2009,84(9-10):311-320.

[18]黃有偉.血瘀與2型糖尿病關系探析[J].長春中醫藥大學學報,2010,26(3):354-355.

Effects of Jinm aitong on Exp ression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in H ippocam pal Neurons Cu ltured w ith H igh G lucose

GUO Lei-lei,ZHANG Hong,TIAN Guo-qing,et al.Peking Union Medical College Hospital and Institute of Basic Medical Sciences,Peking Union Medical College,Chinese Academy ofMedical Sciences,Beijing 100730,China

Ob jectiveTo explore the effectof Jinmaitong(JMT)on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampalneurons cultured w ith high glucose.M ethodsHippocam pal neuronsw ere primarily cultured and purified from the hippocampus of new-born Sprague Daw ley rats.Neuron-specific enolase immunocytochem icalmethod was adopted for the identification of the neurons.They were divided into normal controlgroup,high glucose group,high-dose JMT(JH)group,m iddle-dose JMT(JM)group,low-dose JMT(JL)group and a positive control group.72 hours later,Western blotting was adopted to detect the expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3.Resu ltsCompared w ith the normal control group,the expression of Bax and Caspase-3 in the high glucose group significantly increased(P＜0.01),and the expression of Bcl-2 significantly decreased(P＜0.05).Compared w ith the high glucose group,the expression of Caspase-3 and Bax in the positive control group and JH,JM,and JL groups significantly decreased(P＜0.01),and the expression of Bcl-2 significantly increased(P＜0.05). Com pared w ith the positive control group,the expression of Caspase-3 and Bax significantly decreased in JH,JM,and JL groups(P＜0.05), and the expression of Bcl-2 significantly increased in JH and JM groups(P＜0.05).ConclusionJMTmay reduce apoptosis by inhibiting the expression of Bax and Caspase-3 and promoting the expression of Bcl-2.

diabetesmellitus;cognitive dysfunction;Jinmaitong;hippocampalneurons;Bax;Bcl-2;Caspase-3

R285.5；R587.1

A

1006-9771(2012)04-0324-05

2012-02-13)

首都醫學發展科研基金項目(SF-2009-Ⅲ-29)。

1.中國醫學科學院，北京協和醫學院，a：北京協和醫院；b：基礎醫學研究所，北京市100730。作者簡介：郭蕾蕾(1986-)，女，山東臨沂市人，碩士研究生，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發癥和肺癌的中西醫防治。通訊作者：田國慶。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.003