任務導向性訓練對局灶性腦梗死大鼠前肢運動功能及缺血區突觸素和生長相關蛋白-43表達的影響①

王艷，唐強，朱路，劉宏光，張春艷

·基礎研究·

任務導向性訓練對局灶性腦梗死大鼠前肢運動功能及缺血區突觸素和生長相關蛋白-43表達的影響①

王艷，唐強，朱路文，劉宏光，張春艷

目的觀察任務導向性訓練對局灶性腦缺血大鼠前肢運動功能和缺血區周圍皮質突觸素和生長相關蛋白(GAP)-43表達的影響。方法采用內皮素-1(ET-1)誘導局灶性腦缺血大鼠前肢損傷模型。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、任務導向組和跑臺組，每組又分為3 d、7 d、14 d、21 d 4個亞組，每個亞組各6只。造模后24 h對任務導向組進行前肢抓取訓練，跑臺組給予跑臺訓練，模型組不給予任何干預。用網屏實驗分析大鼠的運動功能，應用免疫組化方法觀察各組不同時間點缺血灶周圍皮質突觸素和GAP-43表達。結果造模后14 d和21 d任務導向組大鼠前肢運動功能優于模型組(P＜0.01)和跑臺組(P＜0.05)。任務導向組缺血區周圍皮質突觸素平均光密度值在造模后14 d和21 d優于模型組和跑臺組(P＜0.05)；任務導向組缺血區周圍皮質GAP-43陽性細胞數量在造模后7 d和14 d優于模型組和跑臺組(P＜0.05)。結論任務導向性訓練法可促進局灶性腦缺血大鼠前肢運動功能的恢復，療效優于動物跑臺訓練，其機制可能是與增強腦缺血區周圍皮質突觸素和GAP-43的表達有關。

任務導向性訓練；腦缺血；前肢運動功能；突觸素；生長相關蛋白-43；跑臺訓練；大鼠

[本文著錄格式]王艷，唐強，朱路文，等.任務導向性訓練對局灶性腦梗死大鼠前肢運動功能及缺血區突觸素和生長相關蛋白-43表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(4):319-323.

腦卒中導致腦部損傷和隨后由于部分腦功能喪失而造成緩慢而不完全的康復，嚴重危害人類生命健康[1]。腦卒中后存活下來的大部分患者均存在肢體功能障礙，嚴重影響生活質量[2]。上肢功能障礙尤為嚴重[3]，它不僅影響粗大動作的技能，更影響精細動作的完成，從而影響患者日常生活活動，降低其生活獨立性。但由于上肢及手功能的復雜性，腦卒中后其功能的恢復往往不盡人意[4]。如何有效地促進腦卒中患者上肢功能的恢復，是我們康復臨床的一個重要課題。本實驗通過觀察任務導向性訓練與動物跑臺訓練對局灶性腦缺血大鼠前肢運動功能及缺血區周圍突觸素(synaptophysin,Syn)和生長相關蛋白-43(grow th associated protein-43,GAP-43)表達的影響，探討腦卒中后促進上肢功能恢復的更為有效的康復方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠96只，體重250～300 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(黑)2008001)。采用隨機區組法將符合標準的96只雄性大鼠分為4組：假手術組、模型組、任務導向組和跑臺組，各組再按腦缺血后不同時間點分為3 d、7 d、14 d、21 d 4個亞組，每組每個時間點各6只大鼠。

1.2實驗試劑和儀器 試劑：內皮素-1(endothelin-1, ET-1)(武漢博士德公司)；突觸素和CAP-43多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。儀器：萊卡2135型切片機(德國)；M oticam3000顯微攝影成像系統(美國)；大鼠立體定位儀；華佗牌針灸針(直徑0.25 mm，蘇州醫療用品有限公司)；前肢抓取訓練盒：參照周佳麗等[5]制作的“抓取測試盒”。訓練盒分三個部分：上方為通道；左側下方為食槽和所連接的階梯式斜坡，在通道底板左側有與食槽連接的縫隙；下方為食槽，通道口一端有與地面連接斜坡，便其大鼠爬入訓練盒中。

1.3方法

1.3.1造模 造模前預訓練：造模前14 d開始對大鼠進行前肢抓取食物(瓜子)能力訓練，每天早晚(空腹)各訓練1次，每次15m in。手術前還要經過適應性跑臺訓練3 d，30m in/d，速度：10m/m in，坡度：0°。

模型制備：參照Gary[6]采用ET-1誘導局灶性腦缺血大鼠前肢損傷模型。首先，大鼠用水合氯醛腹腔麻醉后，將其俯臥于大鼠腦立體定位儀上，于顱頂中線切開皮膚，暴露顱骨。以前囟點和腦中線為標志，分別在前囟點向左旁開3mm、前囟點向前1mm，向左旁開3mm、前囟點向前2mm，向左旁開3mm，用微孔鉆在以上3個位置鉆孔。將ET-1(用生理鹽水稀釋1 μg/μl)放于微量注射器中，在以上各點注射(共0.33 μl)，每點分別向下1.5mm，以30 s的速度將0.1μl的 ET-1注射到每個點上，剩下的0.03μl在最后一點以10 s速度注射完，停留5m in后出針。縫合傷口，并在局部進行消毒防止傷口感染。在手術過程中保持大鼠直腸溫度在(37±5)℃。造模后2 h內所有大鼠被嚴密監護。實驗室溫度控制在(25±1)℃，12 h光暗交替(7:00-19:00照明)，除術前后數日外，食物的攝入量維持在領取時體重的85%，不控制飲水。

1.3.2干預方法

1.3.2.1假手術組 只手術，不造模。大鼠置于籠中飼養，按時間點網屏測試運動能力后處死采集標本。

1.3.2.2模型組 大鼠造模后不給予任何處置，按時間點網屏測試運動能力后處死采集標本。

1.3.2.3任務導向組 造模24 h后僅給予前肢抓取食物能力訓練，方法同造模前預訓練。

1.3.2.4跑臺組 造模24 h后，將大鼠置于不斷向后傳輸的履帶上，為避免履帶尾部電柵欄的電擊，大鼠不斷地在電動履帶上主動向前奔跑。30m in/d，速度：10m/m in，坡度：0°。

1.4運動功能評定 網屏實驗[7]：評分分為4個等級，0分：前抓握住網屏大約5 s，不會掉下來；1分：暫時握住網屏，滑落一段距離，但沒有掉下來；2分：在5 s內掉下來；3分：網屏轉動時，鼠即刻掉下來。

1.5標本采集及指標檢測

1.5.1標本采集 將各組大鼠麻醉后固定于手術臺，暴露心臟后用生理鹽水和4%多聚甲醛(pH=7.4)進行心臟沖洗和灌注后斷頭取腦，將腦組織存放入4%多聚甲醛溶液固定6 h，以備觀察免疫組織化學。

1.5.2指標檢測 經脫水—透明—浸蠟—包埋—切片—脫蠟—脫水，PBS沖洗2m in×3次。滴加一抗(突觸素多克隆抗體，GAP-43多克隆抗體)，PBS沖洗2m in×3次。滴加相應二抗，PBS沖洗2 m in×3次。DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.6圖像處理 采用美國M oticam3000顯微攝影成像系統，每只大鼠選取3張切片，每張切片在顯微鏡下隨機選取3個高倍(400×)視野，觀察GAP-43陽性細胞數目(棕黃色顆粒)。采用M otic ImagesAdvanced 3.2圖像軟件，測定突觸素免疫反應陽性產物的平均光密度值。

1.7統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件進行分析。組間比較用單因素方差分析，若方差齊，則采用LSD法進行分析，若方差不齊，則采用Dunnett法進行分析。

2 結果

2.1運動功能 假手術組大鼠麻醉蘇醒后活動正常，說明假手術本身并未對大鼠的神經功能造成影響。

模型組各時期運動功能評分顯著高于假手術組(P＜0.001)。任務導向組在3 d和7 d時評分與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，14 d和21 d時評分明顯低于模型組(P＜0.01)。跑臺組各時期評分與模型組無顯著性差異(P＞0.05)。跑臺組在3 d和7 d時評分與任務導向組無顯著性差異(P＞0.05)，14 d和21 d評分高于任務導向組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點的運動功能評定比較

2.2突觸素的表達 突觸素陽性細胞呈現黃色，主要表達在缺血區周圍神經元突觸上，少數毛細血管內皮胞質亦有表達，呈現大面積的點狀及片狀黃色區。各組突觸素在3 d時開始出現，但陽性反應較弱，隨著治療時間及方式不同，至21 d時其顏色逐漸加深至棕黃色。

模型組在3 d、7 d時突觸素平均光密度值低于假手術組(P＜0.05)，14 d、21 d時與假手術組無顯著性差異(P＞0.05)。任務導向組在3 d、7 d時突觸素平均光密度值與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，14 d、21 d時高于模型組(P＜0.05)。跑臺組3 d、7 d、14 d時突觸素平均光密度值與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，21 d高于模型組(P＜0.05)。跑臺組3 d、7 d時突觸素平均光密度值與任務導向組無顯著性差異(P＞0.05)，14 d、21 d時低于任務導向組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組缺血區周圍皮質突觸素平均光密度值比較

2.3 GAP-43的表達 GAP-43陽性細胞呈現黃色或棕黃色，主要表達在缺血區周圍神經元胞質中，膠質細胞少量表達。各組GAP-43在3 d時均有所表達，到7 d時達到高峰，隨后亦有不同程度下降。

模型組在3 d、7 d、14 d時陽性細胞多于假手術組(P＜0.05)，21 d時與假手術組無顯著性差異(P＞ 0.05)。任務導向組在3 d時陽性細胞與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，在7 d、14 d時高于模型組(P＜0.05)，21 d時顯著高于模型組(P＜0.001)。跑臺組在3 d、7 d、14 d時陽性細胞與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，21 d時高于模型組(P＜0.05)。跑臺組在3 d、14 d時陽性細胞與任務導向組無顯著性差異(P＞0.05)，7d、21 d時低于任務導向組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組缺血區周圍皮質GAP-43陽性細胞數比較(n)

3 討論

本研究目的是比較任務導向性訓練與動物跑臺訓練對局灶性腦梗死大鼠前肢運動功能及缺血區周圍突觸素和GAP-43表達的影響。本研究結果顯示，任務導向性訓練對局灶性腦梗死大鼠前肢運動功能及缺血區周圍突觸素和GAP-43表達優于動物跑臺訓練。

大腦的可塑性研究證明，腦的功能重組依賴于任務導向性訓練的反復強化[8-9]。任務導向性訓練對運動功能的促進作用機制在于：①反復的任務導向性訓練影響中樞神經系統的適應性，從而促進腦功能的重組[10]；②任務導向性訓練能使神經功能細胞向病灶部位定向遷移，最終形成新的神經網絡，目前已從功能磁共振成像(fMRI)研究中得到證實[11]；③任務導向性訓練針對功能障礙，效果顯著；④任務導向性訓練強調目標及任務的具體性而非抽象性。比如大鼠前肢抓取食物，這是一項具體的任務，操作時涉及到視覺和觸覺的輸入，大腦對信息的判斷和整合以及神經對運動的有效支配等，再經過失敗和成功的反饋，不斷調整運動模式，形成優化的神經網絡和運動程序，支配相關肌肉特定的順序、速度和力量等力學特點，配合完成這項具體任務，促進發展適應能力、前饋能力和協調能力[12]；⑤任務導向性訓練強調反復強化，訓練不僅要具有功能性，還要有一定量的積累，這樣才能促進中樞神經系統的功能重建；⑥任務導向性訓練強調主動參與性。主動運動對調整神經網絡以形成最佳運動模式起著重要作用[12]。

動物跑臺訓練作為一種康復手段已經廣泛應用于臨床與動物實驗中。有研究顯示，動物跑臺訓練能縮小腦梗死體積，促進神經功能的恢復[13]。但也有研究顯示，動物跑臺訓練作為一種強迫式運動能增加血清皮質醇的含量，增加慢性應激，對腦卒中的康復有著負面的影響[14-16]。與本研究的結果相似。

GAP-43是一種與神經軸突生長相關的磷酸蛋白，其含量在生長及再生的神經組織中尤其在生長錐內非常高，故常被作為了解神經組織生長和再生情況、衡量其可塑性大小的一個指標。通過對GAP-43分布、含量及表達的測定，可以準確了解神經纖維增生的部位與程度。突觸素是一種分子量為38 KDa的糖蛋白，定位于各種神經末梢的突觸前囊泡上，可作為突觸前膜的特異性標志。它與突觸的形成有關，其含量高低可準確反映突觸數目的多少。因此，GAP-43、突觸素等與神經可塑性密切相關，其基因表達與蛋白含量的變化可直接影響到相互聯系的神經元數目、突觸數量，被認為是神經可塑性的標志蛋白[17]。

本實驗結果顯示，大鼠局灶性皮質性腦缺血造模后，突觸素陽性細胞表達在第3天較弱，第7天開始逐漸升高，至第21天繼續維持高水平，與Bolay等[18]的研究相似。胡昔權等在大鼠腦梗死造模第3天GAP-43陽性神經元數量表達逐漸升高，第7天達高峰，隨后又明顯下降[17]，提示該時期缺血的大腦正處于可塑性和功能重組的活躍狀態。以上研究結果與本實驗結果基本一致。任務導向性訓練可以促進突觸素表達并保持較高水平，并對GAP-43可以提高陽性表達，并延緩其下降的趨勢。在形為學評分上，造模后各組7 d和21 d網屏實驗評分，任務導向組均高于同期跑臺組和模型組。

綜上所述，本研究表明任務導向性訓練能促進腦梗死大鼠前肢的運動功能的康復，其機制可能與腦梗死灶邊緣皮質GAP-43和突觸素的表達上調有關。有待于進一步的研究。

[1]Ruscher K,Sham loo M,Rickhag M,et al.The sigma-1 receptor enhances brain plasticity and functional recovery after experimental stroke[J].Brain,2011,28(10):1-15.

[2]Mayo NE,Wood-Dauphinee S,C?téR,etal.Activity,participation,and quality of life 6 months poststroke[J].A rch Phys Med Rehabil,2002,83(8):1035-1042.

[3]K rabben T,Prange GB,Molier,et al.Objective measurement of synergisticmovementpatternsof the upper extrem ity following stroke:An explorative study[C].IEEE Int Conf Rehabil Robot,2011:1-5.

[4]Cauraugh JH,Summers JJ.Neural plasticity and bilateralmovements:a rehabilitation approach for chronic stroke[J].Prog Neurobiol,2005,75(5):309-320.

[5]周佳麗,祝慧鳳,萬東,等.“抓取測試盒”對局灶腦缺血大鼠前肢功的評價[J].中國藥理學通報,2008,24(11):1531-1533.

[6]Gilmour G,Iversen SD,O’Neill MF,et al.Amphetam ine promotes task-dependent recovery follow ing focal cortical ischaem ic lesions in the rat[J].Behav Brain Res,2005,165: 98-109.

[7]杜厚偉,劉楠,陳榮華,等.康復訓練對腦缺血大鼠神經功能恢復和腦組織中白介素-10含量變化的影響[J].中華物理醫學與康復雜志,2006,28:149-152.

[8]Page SJ.Intensity versus task-specificity after stroke:how important is intensity[J].Am JPhys Med Rehabil,2003,82(9): 730-732.

[9]Shepherd RB,Carr JH,A lison JA,et al.A random ized controlled trial of the effects of intensive sit-to-stand training after recent traumatic brain injury on sit-to-stand performance[J]. Clin Rehabil,2003,17(4):355.

[10]王寧華.腦卒中康復治療的循證醫學及規范化[J].中華老年心血管病雜志,2008,10(9):650-652.

[11]Kimberley TJ,Lew is SM,Auerbaeh EJ,et al.Analysis of fMRI and finger tracking training in subjects w ith chronic stroke[J].Brain,2002,125(4):773-788.

[12]黃真.“運動再學習”相關理論及其在腦性癱瘓康復中的應用[J].中國康復醫學雜志,2007,22(7):652-655.

[13]Hayes K,Sprague S,Guo M,etal.Forced,notvoluntary,exercise effectively induces neuroprotection in stroke[J].Acta Neuropathol,2008,115:289-296.

[14]Soya H,Nakamura T,Deocaris CC,et al.BDNF induction w ith m ild exercise in the rat hippocampus[J].Biochem Biophys Res Comm,2007,358:961-967.

[15]Brown DA,Johnson MS,A rmstrong CJ,et al.Short-term treadm ill running in the rat:what kind of stressor is it?[J].JAppl Physiol,2007,103:1979-1985.

[16]Ke Z,Yip SP,Li L,et al.The Effects of voluntary,involuntary,and forced exercises on brain-derived neurotrophic factor and motor function recovery:a rat brain ischem ia model[J]. PLoSOne,2011,6(2):e16643.

[17]胡昔權,鄭海清,燕鐵斌,等.康復訓練對腦梗死大鼠運動功能及GAP-43、SYN表達的影響[J].中華物理醫學與康復雜志, 2008,30(4):217-221.

[18]Bolay H,Gürsoy-Ozdem ir Y,Sara Y,etal.Persistent defect in transm itter release and synapsin phosphorylation in cerebral cortex after transient moderate ischem ic injury[J].Stroke, 2002,33(5):1369-1375.

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Effects of Task-oriented Training on Forelim b M otor Function and Exp ression of Synap tophysin and G row th Associated Protein-43 in Ratsafter Focal Cerebral Ischem ia

WANG Yan,TANG Qiang,ZHU Lu-wen,etal.The Second Affiliated Hospital ofHeilongjiang University ofChinese Medicine,Harbin 150001,Heilongjiang,China

Ob jectiveTo explore the effects of task-oriented training on forelimb motor function and expression of synaptophysin and grow th associated protein(GAP)-43 in rats after focal cerebral ischem ia.M ethodsEndothelin-1(ET-1)was used to induce focal cerebral ischem ia model in rats w ith forelimb dysfunction.The rats were random ly divided into 4 groups:sham operation group,model group, task-oriented training group and treadm ill running group,each group was divided into 4 subgroupsby 3 d,7 d,14 d,and 21 d.24 hours after modeling,the rats in task-oriented training group were trained w ith forelimb reaching and the rats in the treadm ill running group were trained by treadm ill,and themodel group had no intervention.Motor function of rats was evaluated by net screen test,and immunohistochem istry staining was used to observed the expression of GAP-43 and synaptophysin in cortical ischem ia lesions of the rats in each group at different time points.Resu ltsThe scores of behavioral tests were better in the task-oriented training group than in themodel group(P＜0.01)and the treadm ill group(P＜0.05)on the 14th and 21st days aftermodeling.The expression of GAP-43 was higher in the task-oriented training group than in themodel group(P＜0.05)and the sham group(P＜0.01)on the 7th and 21st days aftermodeling.The expression of synaptophysin was higher in the task-oriented training group than in themodelgroup(P＜0.05)and the sham group(P＜0.05)on the 14th and the 21stdaysaftermodeling.ConclusionTask-oriented training can facilitate the recovery of forelimbmotor function of ratsafter focal cerebral ischem ia,and itmay be partially related to the up-regulation of expression of GAP-43 and synaptophysin in peri-infarction cortex.

task-oriented training;cerebral ischem ia;forelimbmotor function;synaptophysin;grow th associated protein-43;treadm ill running;rats

R743.3

A

1006-9771(2012)04-0319-05

2012-03-12)

哈爾濱市科技局科技創新人才專項基金(2011RFXYS072)。

黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市150001。作者簡介：王艷(1967-)，女，遼寧莊河縣人，博士研究生，主任醫師，主要研究方向：神經損傷康復。通訊作者：唐強。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.002