海洋來源真菌中二個聚酮類化合物的NMR研究

劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會明

(1.中國醫科大學藥學院，遼寧 沈陽 110001；2.沈陽藥科大學 創新藥物研究與設計教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110016；3.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；4.青島科技大學，山東 青島 266042)

海洋微生物資源豐富，獨特的代謝和生理特性使其能夠產生化學結構特殊的次級代謝產物，特別是其中結構新穎、具有抗腫瘤作用的代謝產物越來越受到國內外科研工作者的重視[1，2]。為了尋找新的抗癌活性物質，作者對海洋來源真菌Penicilliumsacculum的次級代謝產物進行了研究，從中分離得到2個聚酮類化合物Griseophenone B(Ⅰ)和Griseophenone C(Ⅱ)，文獻中只有化合物Ⅰ的1HNMR數據報道。作者應用1D NMR和2D NMR(HSQC，HMBC)等技術確定了2個化合物的結構，并利用2D NMR技術對其核磁共振信號進行了歸屬。

1 實驗

1.1 儀器與測試條件

核磁共振一維和二維譜分別用瑞士Bruker ARX-300型及Bruker AVANCE-600型核磁共振儀測定。測試條件：溶劑為CDCl3，內標為TMS(四甲基硅烷)，室溫下測定。2D NMR(HSQC，HMBC)采用標準脈沖程序，HSQC采樣數矩陣1024×256，選取C-H鍵偶合常數JCH=140 Hz以獲取碳氫直接相關峰；HMBC采樣數矩陣2048×209，選取JCH=145 Hz、C-H遠程偶合常數nJCH=5 Hz以獲取碳氫遠程相關峰。

1.2 菌株鑒定與發酵

實驗菌株于2004年8月分離自東營潮間帶鹽生植物濱藜(Atiriplexsp.)，由國家海洋局第一海洋研究所、青島科技大學田黎教授鑒定為真菌(Penicilliumsacculum)。菌株編號：HTTM-Z04003，存放于國家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫。

發酵培養基及條件：馬鈴薯浸汁200 mL，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，葡萄糖15 g，陳海水1000 mL。24 ℃、150 r·min-1下振蕩培養17 d，發酵量75 L。

1.3 提取分離

將海洋來源Penicilliumsacculum的75 L發酵液過濾，得濾液65 L，減壓濃縮至6 L，分別用等體積的乙酸乙酯萃取3次，回收溶劑，得浸膏93.5 g。經硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)進行梯度洗脫，得到141個流分(500 mL/流分)。第6～7流分合并，經Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進行洗脫，第13～14亞流分，經硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(15∶1～2∶1)梯度洗脫，經重結晶及HPLC，得到化合物Ⅰ(4 mg)和化合物Ⅱ(3 mg)。

1.4 分析測試

對化合物(Ⅰ)、化合物(Ⅱ)分別進行定性分析和質譜檢測。

取化合物Ⅰ(4 mg)、化合物Ⅱ(3 mg)分別溶于0.5 mL氘代試劑CDCl3中進行NMR測定。

2 結果與討論

2.1 化合物Ⅰ的結構解析

黃白色無定形粉末，UV 254 nm下有很淡的暗斑，10％硫酸乙醇顯淡黃色，硫酸乙醇顯色后，UV 365 nm下熒光為黃綠色。HRESI-MS，m/z：337.0483[M-H]-，推測分子量為338，確定分子式為C16H15O6Cl，不飽和度為9。

1HNMR(300 MHz,CDCl3)給出δ6.36(2H，br s)，在HSQC譜中與δC97.6、110.1存在相關，由經驗可知該信號為2個芳氫(或烯氫)信號。同理，由HSQC譜中δH6.14和δC93.1相關，可知δH6.14為1個芳氫(或烯氫)信號。1HNMR(300 MHz,CDCl3)給出2個甲氧基的質子信號δ3.71(3H，s)、3.93(3H，s)和1個甲基信號δ2.16(3H，s)。13CNMR(150 MHz，CDCl3)給出2個甲氧基信號δC56.6、56.1和1個甲基信號δC19.1(由HSQC相關信號推斷)，此外，δC198.3根據經驗推測為酮羰基的碳信號，然后根據分子式給出16個碳，分子中應該還有12個碳信號(而圖譜中只給出11個sp2雜化碳信號，δC163.8的碳信號并未觀察到，而是通過與δH6.14遠程相關推斷出的)。該化合物的不飽和度u=9(δC198.3 C=O為1個不飽和度)，因此剩下的12個碳信號應該滿足8個不飽和度，故推測分子中含有2個苯環結構。根據分子式C16H15O6Cl和已確定的原子數，還余下3個O和3個H，推測結構中存在3個羥基。

化合物Ⅰ的HMBC譜見圖1、主要的HMBC相關見圖2。

圖1 化合物Ⅰ的HMBC譜

圖2 化合物Ⅰ主要的HMBC相關

HMBC譜(圖1、圖2)顯示CH3(δ2.16，s)與C-5(δ110.1)相關，表明CH3取代在苯環上C-5的鄰位。根據HSQC譜中C-5(δ110.1)/δH6.36的交叉峰，可歸屬H-5(δ6.36)信號。HMBC譜中H-5(δ6.36，br s)和C-3(δ97.6)有遠程相關，再根據HSQC譜中C-3(δ97.6)/δH6.36的交叉峰，可歸屬H-3(δ6.36)信號，而HMBC譜中H-3(δ6.36，br s)與C-5(δ110.1)有遠程相關，并結合氫信號的裂分情況，推斷H-3和H-5處于苯環的間位。根據H-3和H-5、C-3和C-5的信號處于較高場，推斷其鄰位應為含氧取代。2-OCH3(δ3.71，s)與C-2(δ157.9)有遠程相關，H-3(δ6.36，br s)與C-2(δ157.9)有遠程相關，證明2-OCH3為H-3鄰位的1個含氧取代基，表明該OCH3位于C-2位，則C-4位為羥基取代。因此，剩下的2個OH、1個OCH3、1個Cl及1個芳氫信號均在另一個苯環上取代。根據δH6.14處于較高場，推斷其鄰位均為含氧取代。H-5′(δ6.14，br s)與C-4′(δ162.1)、C-6′(δ163.8)有遠程相關，而與第3個含氧碳不存在遠程相關，4′-OCH3與C-4′有遠程相關，證明H-5′處于OH和OCH3的鄰位，而處于另一個OH的對位。氯原子取代在3′位，可根據取代基對苯環碳信號的影響情況計算而確定[3]。至此，還剩下1個羰基，2個苯環也都剩下1個取代位置，因此確定是兩個苯環由羰基連接的結構。綜合以上推導，并結合文獻[4～6]確定化合物Ⅰ為Griseophenone B，結構見圖3。

化合物Ⅰ.R=Cl 化合物Ⅱ.R=H

2.2 化合物Ⅱ的結構解析

黃褐色無定形物，10％硫酸乙醇顯淡黃色，UV 254 nm下有很淡的暗斑，10％硫酸乙醇顯色后，UV 365 nm下熒光變為藍綠色。ESI-MS，m/z：305.2[M+H]+，327.2[M+Na]+，推測分子量為304。

NMR數據和化合物Ⅰ非常接近，主要區別在于該化合物多了一個芳氫信號，結合化合物Ⅰ與化合物Ⅱ的質譜給出的分子量338和304，推測化合物Ⅰ中的氯原子在化合物Ⅱ中被氫取代。1HNMR(300 MHz,CDCl3)中給出δ5.98(2H，br s)信號，13CNMR(300 MHz，CDCl3)中給出δ94.7(C-2)信號，HSQC顯示δH5.98與δC94.7相關，推測存在對稱苯環結構。根據HMBC相關(圖4)可確定A環的取代情況(參照化合物Ⅰ)，對比化合物Ⅰ及1D NMR和HSQC給出的對稱苯環結構信息，可進一步確定B環的結構。在碳譜中，該化合物只顯示出10個芳香碳，和化合物Ⅰ相同，C-2′和C-6′也未給出信號。從結構上分析，可能是由于自身為芳香季碳以及羥基取代和鄰位羰基取代等因素影響，使其縱向弛豫時間T1延長，從而使碳信號強度減弱；再者，測試化合物的量較少也影響了碳信號強度。結合文獻[4，7]確定化合物Ⅱ為Griseophenone C(圖3)。

圖4 化合物Ⅱ的主要HMBC相關

參照文獻[8～10]的方法，通過HSQC、HMBC等2D NMR技術對化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的1HNMR和13CNMR信號進行了詳細歸屬,見表1。

表1 化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的NMR數據

3 結論

綜合利用1D NMR(1H，13C)和2D NMR(HSQC，HMBC)技術對從海洋來源真菌Penicilliumsacculum發酵液乙酸乙酯提取物中得到的2個聚酮類化合物(Griseophenone B和Griseophenone C)的結構進行了解析，首次報道了化合物Ⅰ的13CNMR數據以及化合物Ⅱ的核磁共振數據，并對核磁共振信號進行了歸屬。化合物Ⅱ為首次從該種真菌中分離得到。

本研究中的2個化合物由于13CNMR譜均未給出C-2′和C-6′信號，給結構鑒定帶來了一定難度。作者通過高分辨質譜，正確判斷化合物的分子式后，再應用2D NMR進行解析，確定了化合物的結構。文中化合物的解析過程和數據歸屬為該類化合物的結構確證提供了參考。

致謝：1D NMR和2D NMR均由沈陽藥科大學測試中心李文和沙沂老師測試，在此表示感謝！

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