離子束注入改造壬二酸生產菌株的初步研究

于 平，孫弘宇

(中國石油大慶煉化公司，黑龍江 大慶 163411)

壬二酸分子式為C9H11O4，又稱杜鵑花酸，是一種直鏈飽和二元酸，主要用于制備增塑劑、潤滑劑及特殊塑料和化學纖維等。目前國內外壬二酸的制備方法主要有不飽和脂肪酸的氧化裂解、醇醛等有機物的氧化反應以及生物法等。

利用微生物(如熱帶假絲酵母)發酵氧化制備壬二酸，原料來源充足(石油煉制的副產物正構烷烴)、生產條件溫和(常溫、常壓)、工藝簡單、成本低、污染少、產品純度高。在熱帶假絲酵母轉化烷烴生成長鏈二元酸的代謝過程中，烷烴被吸收進細胞后首先經α-氧化生成α-一元酸，接著經ω-氧化生成目標產物α、ω-二元酸。此外，α、ω-氧化過程中生成的一元醇和一元酸都可以被肉毒酰轉移酶(CoT酶)轉移進入微體中經過β-氧化而代謝消耗掉。要使生物體內積累壬二酸，必須抑制β-氧化，加強菌體的α、ω-氧化。催化菌體的α、ω-氧化的酶均是由細胞色素P450酶和羥基化酶組成的復合酶，其中細胞色素P450酶可以經誘導產生。因而高產壬二酸菌株必須滿足兩個條件：(1)菌株的α、ω-氧化能力強，在碳水化合物中生長良好、產酸高；(2)菌株的β-氧化能力相對較弱，難以利用烷烴或同化烷烴生長，對壬二酸的降解能力差[1～4]。

近年來，壬二酸生產菌株的選育主要通過物理化學誘變方法來進行，隨著基因工程技術的發展，新興的離子束生物技術也被應用于長鏈二元酸生產菌株的改造[5～10]。作者在此采用低能離子束注入的方法對壬二酸生產菌種改造進行了初步的研究。

1 實驗

1.1 菌種

熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)TSW-1。

1.2 主要培養基

麥芽汁斜面培養基：12 Brix麥芽汁，瓊脂2％。

種子培養基：KH2PO40.8 g，玉米漿0.3 g，酵母膏0.3 g，n-C95 mL，蒸餾水100 mL，pH值5.0。

篩選培養基：

SEL-1培養基：NaH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO45 g，n-C920 mL，2％瓊脂，蒸餾水100 mL，pH值7.0。

SEL-2培養基：NaH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO45 g，葡萄糖3 g，2％瓊脂，蒸餾水100 mL，pH值7.0。

SEL-3培養基：蔗糖3 g，NaH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，酵母膏0.1 g，玉米漿1 g，尿素0.14 g,n-C920 mL，pH值9.0，1％～3％的酚紅指示劑。

發酵培養基：KH2PO40.8 g，NaCl 0.1 g，玉米漿1 g，酵母膏0.2 g，n-C915 mL，蒸餾水100 mL，pH值5.0。

以上培養基均在 121 ℃下滅菌20 min。

1.3 誘變育種及篩選方法

1.3.1 誘變方法

1.3.1.1 樣品制備

將出發菌株接種于麥芽汁斜面培養基上，30 ℃活化48 h，用5 mL無菌水洗滌菌苔，制成菌懸液。取0.5 mL菌懸液接入裝有50 mL液體種子培養基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、110 r·min-1振蕩培養至對數生長后期。取10 mL培養液于無菌離心管中，3000 r·min-1離心10 min，收集菌體，無菌水洗滌3次，將菌體懸浮于10 mL無菌水中，經適當稀釋(104)后取5 μL，均勻涂布于2 cm×2 cm的無菌玻片上(以在顯微鏡下觀察不相重疊為宜)，無菌風吹干待用。

1.3.1.2 存活率測定

將含菌玻片放入離子束注入儀，抽真空至1×10-4Pa，選擇注入能量和劑量，采用脈沖注入，每個脈沖注入55 s，以消除大劑量下熱效應產生的副作用。離子束注入后取出玻片，置于裝有20 mL蒸餾水的無菌搖瓶中110 r·min-1洗脫菌株，分別取不同種類、能量、劑量的處理液各1 mL適當稀釋，進行活菌計數。以注入量為0時的活菌數為基準，計算不同種類、能量、劑量注入下該菌株的存活率，以注入劑量為橫坐標、存活率為縱坐標繪制存活率曲線。

1.3.1.3 誘變

按照與存活率測定相同的方法，選擇不同種類、劑量、能量進行離子束注入，注入結束后，取出玻片，置于裝有50 mL液體種子培養基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、110 r·min-1振蕩洗脫菌體。

1.3.2 壬二酸突變株的篩選

將洗脫下的菌體經適當稀釋后在麥芽汁平板上均勻涂布，28 ℃培養3 d，用無菌牙簽挑取單菌落分別一一對應接種于SEL-1培養基和SEL-2培養基上，再培養3 d，選擇在SEL-1培養基上不生長、在SEL-2培養基上生長旺盛的菌株，接種于SEL-3培養基中，測定不同菌株在SEL-3培養基上的R*值(菌落產酸面積/菌落面積)，選擇R*值大的菌株進一步進行搖瓶發酵，測定壬二酸的產率，選擇產率最高者作為生產菌株。

1.4 分析方法

菌體濃度用721型分光光度計在620 nm波長、1 cm光程的比色皿中測定。

壬二酸的檢測采用酸堿滴定法。

2 結果與討論

2.1 離子束注入選育壬二酸生產菌株

研究發現，出發菌株TSW-1產酸能力較弱，且發酵周期長。

采用不同種類、不同能量的離子在不同劑量下注入TSW-1進行誘變，注入后菌株的存活率曲線如圖1所示。

注入劑量/×1017ions·cm-2

2.2 壬二酸突變菌株的篩選(表1)

表1 離子束注入后突變株的篩選

表2 烷烴利用減弱型或缺陷型菌株產酸能力

從表2可以看出，經離子束注入后，許多突變株的壬二酸產率有了大幅的提高，尤其是TSW-b-B7、TSW-b-B8壬二酸產率分別高達35.75 g·L-1、32.34 g·L-1。對其進行積累壬二酸的穩定性實驗，結果如表3所示。

從表3可以看出，TSW-b-B7和TSW-b-B8菌株遺傳7代后，其壬二酸產率仍比較穩定，在該劑量處選育的突變株其存活率正處于馬鞍型曲線的谷底，這與紫外線、X-射線和乙烯亞胺等多種誘變得到的正向突變較多出現在偏低劑量中一致，但要證明這一點尚需進一步研究。TSW-b-B7的壬二酸產率較高且較穩定，最高達35.81 g·L-1，較出發菌株提高了74.17％，為最佳壬二酸突變菌株，將其編號為TSW-35，并對其菌落特性進行研究。

表3 積累壬二酸穩定性實驗/g·L-1

2.3 離子束注入對菌落形態的影響

將出發菌株TSW-1和TSW-35涂平板培養3 d后進行觀察，結果如4所示。

表4 離子束注入對菌落外觀形態的影響

從表4可以看出，離子束注入對菌落外觀有明顯的誘變影響。因此，可以通過觀察菌落形態對菌株產酸能力進行初步判斷。

3 結論

采用離子束注入法對壬二酸生產菌株進行改造，通過對照培養基和指示劑培養基篩選α、ω-氧化能力增強以及β-氧化能力減弱的突變株，得到一株壬二酸產率達到35.81 g·L-1的菌株TSW-35，壬二酸產率比出發菌株提高了74.17％。

離子束注入作為新興的誘變手段，能夠在其它誘變方法無能為力的情況下誘發突變產生，其存活率曲線為典型的“馬鞍型”，能夠在低致死(存活率20％～30％)的情況下誘發大量正突變菌株。

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