基于細胞性質分析不同有機溶劑對簡單節桿菌C1,2脫氫反應的影響

駱健美,宋 妍,王建鋒,寧 靜,成永新,鄭 宇,申雁冰

(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學) 天津市工業微生物重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

微生物的C1,2位脫氫反應是工業生產氫化潑尼松及其同系物最有價值的一類反應，也是工業上采用發酵法生產甾體藥物的典型代表。甾體藥物母核C1,2位引入雙鍵后，能成倍地提高抗炎和抗過敏活性，副作用也更小[1，2]。在眾多具有C1,2位脫氫能力的微生物中，簡單節桿菌(Arthrobactersimplex)以專一性高、反應速度快等優點成為研究和應用較廣泛的菌株[3，4]。甾體化合物的生物轉化反應中底物的難溶性是限制轉化反應效率的重要瓶頸[5]。目前，工業上主要通過加入有機溶劑提高底物的溶解度，其中，甲醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)的應用最為廣泛[6～10]。

研究者大多將有機溶劑加入后轉化反應效率的提高歸結為底物的增溶作用。但事實上，添加有機溶劑后轉化反應中微生物的各種生理性質都會發生變化，進而對轉化反應產生影響。駱健美等[11]研究發現，不同濃度乙醇對甾體C1,2脫氫反應菌種——簡單節桿菌的結構、生長和生理代謝產生影響。乙醇濃度的增大使得微生物的代謝活力和跨膜電位下降、細胞膜通透性增強，當乙醇濃度為8％時，細胞完整性明顯被破壞。

作者以簡單節桿菌TCCC 11037催化醋酸可的松(CA)的C1,2脫氫反應為模型，通過分析4種有機溶劑甲醇、乙醇、DMSO和DMF加入后微生物的細胞存活率、生理代謝活力、細胞膜通透性及細胞完整性的變化，探討不同有機溶劑下轉化反應效率產生差異的原因，擬為今后從細胞學特性方面加以改善，以進一步建立提高有機介質微生物轉化反應效率的新方法提供理論指導。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株

簡單節桿菌(Arthrobactersimplex)TCCC 11037，天津科技大學生物工程學院微生物制藥研究室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

醋酸可的松(CA)及醋酸潑尼松(PA)標準品，天津市藥檢所；其它試劑及藥品均為市售分析純。

JSPM-5200型原子力顯微鏡；F-5301PC型熒光分光光度計；SBA-90型生物傳感儀；Agilent 1100 Series LC型高效液相色譜儀(G1314Pump，G1322ADEGASSER G1314VWD檢測器，20 μL AN進樣器，Hp ChemStation)。

1.1.3 培養基

斜面培養基、種子培養基和菌體培養基參照文獻[12]配制。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養

將接種的斜面培養基置于培養箱中30 ℃恒溫培養1～2 d。

1.2.2 種子培養

從斜面挑取1環菌種，接種于裝有30 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，在160 r·min-1、32 ℃下培養18 h。

1.2.3 二級培養

按5％(體積比)的接種量將上述種子培養液接種于裝有30 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，在160 r·min-1、32 ℃下培養24 h。

1.2.4 醋酸可的松的生物轉化

向培養體系中分別添加4％(體積分數，下同)的甲醇、乙醇、DMSO、DMF，然后干粉投料(投料比5％)，在160 r·min-1、32 ℃下進行醋酸可的松的轉化，期間不斷取樣，測定轉化率和初始轉化速率并表征各種細胞性質。以不加有機溶劑的培養體系為對照。

1.2.4.1 轉化率的測定

取500 μL轉化培養液，加入到1 mL乙酸乙酯中終止轉化反應。取適量有機相揮干后，加入1 mL流動相重新溶解，用0.45 μm有機膜過濾后進樣20 μL，HPLC分析測定底物轉化率。由于樣品中只含有底物CA和產物PA，且兩者在240 nm下響應面積非常接近，因此，可采用面積歸一化法檢測CA轉化率。

HPLC條件：色譜柱為Kromasil 100-5SIL(250 mm×4.6 mm)；流動相為二氯甲烷-乙醚-甲醇(86∶12∶2，體積比)，0.5 μm微孔濾膜過濾；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長240 nm。

1.2.4.2 初始轉化速率的測定

菌體在分別添加4％的甲醇、乙醇、DMSO、DMF 4種有機溶劑的培養體系中進行醋酸可的松的轉化，并于10 min后取樣測定底物初始轉化速率。反應速率以單位時間單位轉化液體積中底物轉化量來表示，單位為mg·mL-1·min-1。

1.2.5 細胞存活率的測定

采用10倍逐級稀釋的方法于固體培養基平板中進行活菌計數，32 ℃倒置培養2～3 d，統計每皿的菌落數(每個稀釋度做3個平行)。

1.2.6 糖代謝活力保留值(R)的測定

向離心收集后的菌體細胞中加入10 g·L-1葡萄糖水溶液10 mL，160 r·min-1、32 ℃下處理8 h后，取1 mL樣品，用生物傳感儀測定葡萄糖濃度。

1.2.7 超顯微結構觀察

轉化培養液離心，洗滌2次后，將細胞固定在2.5％的戊二醛溶液中置于4 ℃冰箱過夜，將細胞濃度調至相同的菌懸液小心滴于蓋玻片上，待水分自然晾干，用原子力顯微鏡檢測。成像在大氣環境下進行，掃描模式為輕敲模式。所有圖像均通過自動平滑和低通濾波處理以消除慢掃方向的低頻噪音。

1.2.8 細胞膜通透性的測定

FDA是一種不帶電荷的親脂性分子，本身不發熒光，但進入細胞后可被胞內脂肪酶水解產生熒光素。因此，可以利用熒光光度計檢測菌液熒光強度的大小表征細胞膜的通透性。

轉化培養液離心，洗滌2次后，生理鹽水重懸，并將其OD600值調至0.8，此時細胞濃度約為1×107個·mL-1。FDA(最大激發波長492 nm，發射波長513 nm)用丙酮新鮮配制成濃度為2 mg·mL-1的貯備液，按1×107個·mL-1細胞加25 μL，使細胞終濃度為25 μg·mL-1，37 ℃水浴保存2 min后，檢測菌液熒光強度。

2 結果與討論

2.1 不同有機溶劑對簡單節桿菌轉化醋酸可的松的影響

考察不同有機溶劑下簡單節桿菌轉化醋酸可的松的最終轉化率和初始轉化速率，結果見圖1、圖2。

圖1 不同有機溶劑下簡單節桿菌生物轉化醋酸可的松24 h的轉化率

由圖1可知，有機溶劑的加入有利于醋酸可的松的生物轉化，其中，添加乙醇時的最終轉化率最高，達到85.26％，其余由高到低依次為DMSO 80.215％、甲醇69.785％、DMF 67.217％。

圖2 不同有機溶劑下簡單節桿菌生物轉化醋酸可的松的初始轉化速率

由圖2可知，4種有機溶劑中，DMSO加入后，醋酸可的松的初始轉化速率最高，為2.089 mg·mL-1·min-1，其次為甲醇1.913 mg·mL-1·min-1，而乙醇和DMF加入后初始轉化速率比較接近，均與對照組相差不大。

2.2 不同有機溶劑對菌體存活率的影響(圖3)

圖3 不同有機溶劑對簡單節桿菌存活率的影響

菌體存活率反映不同有機溶劑對簡單節桿菌的毒害作用。由圖3可知，添加4種有機溶劑后，簡單節桿菌的細胞存活率均有不同程度的降低，其中DMF加入后細胞存活率下降速度最快，24 h時細胞存活率僅為2.50％；甲醇和乙醇的影響較小，24 h時細胞存活率分別為32.29％和25.10％，遠高于DMF和DMSO。4種有機溶劑對簡單節桿菌的毒害作用由強到弱依次為DMF>DMSO>乙醇>甲醇。

2.3 不同有機溶劑對菌體糖代謝活力保留值的影響(圖4)

圖4 不同有機溶劑下簡單節桿菌的糖代謝活力保留值

糖代謝活力保留值(R)表征有機溶劑對簡單節桿菌生理代謝活力的影響。由圖4可知，有機溶劑存在時，菌體的糖代謝活力均大幅度降低，其中DMF處理時的R值最小，僅為18.49％；而乙醇和甲醇處理時菌體仍能保持較好的生理活性，其糖代謝活力保留值分別為25.34％和24.07％。這和不同有機溶劑對菌體存活率的影響基本一致。說明細胞生理代謝活力的變化直接決定了微生物在有機溶劑下的存活能力。

2.4 不同有機溶劑對菌體超顯微結構的影響(圖5)

圖5 不同有機溶劑加入時簡單節桿菌的超顯微結構

由圖5可知，未經有機溶劑處理的簡單節桿菌細胞形狀較規則，多為短桿形，細胞膜光滑完整。有機溶劑處理后菌體的細胞完整性和表面形態受到一定程度影響。其中，4％DMSO處理后的細胞出現了一定程度的收縮，部分細胞表面出現凹陷；4％甲醇和4％乙醇處理后的細胞長徑的收縮更加嚴重，能觀察到胞漿流出；4％DMF處理后的細胞大小無明顯改變，但個別細胞的形狀出現不規則變化，部分細胞表面有小體產生。由此可知，甲醇和乙醇的處理使細胞的完整性受到的影響較大。

2.5 不同有機溶劑對菌體細胞膜通透性的影響(圖6)

圖6 不同有機溶劑對細胞膜通透性的影響

由圖6可知，添加DMSO、DMF、甲醇、乙醇時細胞的熒光強度分別為對照組的108.297％、101.967％、116.366％、110.117％，這說明4種有機溶劑的加入都使細胞膜通透性增大。其中，甲醇和乙醇處理時細胞膜通透性增大較為明顯，而DMF對細胞膜通透性的影響最小。進一步證實了細胞完整性的觀察結果，說明4種有機溶劑中，甲醇和乙醇對細胞完整性和膜通透性的影響較為顯著。

3 結論

乙醇、DMF、DMSO、甲醇等4種有機溶劑加入后，簡單節桿菌生物轉化醋酸可的松的C1,2脫氫反應過程的初始轉化速率和最終轉化率均有所提高。但不同有機溶劑下菌體的初始轉化速率差異不大，而最終轉化率存在明顯差異。其中，轉化率從高到低依次為乙醇>DMSO>甲醇>DMF。4種有機溶劑對簡單節桿菌細胞存活率和代謝活力的影響趨勢基本一致，其中DMF的影響最大，DMSO次之，乙醇和甲醇影響較小。4種有機溶劑中，甲醇對簡單節桿菌細胞完整性的影響最大，乙醇次之，DMF和DMSO差別不明顯；4種有機溶劑對簡單節桿菌細胞膜通透性的影響大小依次為甲醇>乙醇>DMSO>DMF。通過上述細胞性質的分析，可以認為，4種不同有機溶劑加入時，細胞生理代謝活力和細胞膜通透性的差異是造成轉化率水平不同的重要原因。其中，細胞膜通透性的增強有利于底物分子更容易進入細胞與生物酶接觸，進而提高轉化率。綜合考慮，乙醇是較為適合的有機溶劑。

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