纖維素酶產生菌的篩選及產酶條件優化

曾 露，李群良，嚴 偉，何查霖，何曙光

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西來源生物動力農業投資有限公司，廣西 南寧 530008)

植物纖維素約占植物體干重的33.4％～50.0％,是地球上最豐富的有機物質。但是，由于纖維素中存在許多高能的氫鍵，因此其水解、利用均很困難。世界上每年平均生成約1500億～2000億t植物性有機物，其中約有一半為纖維素類物質,而能利用的只有一小部分,絕大部分都被棄置[1]。因此，如何更有效地開發和利用纖維素資源已成為研究熱點。

纖維素酶是使纖維素分解生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是將纖維類物質酶法水解成葡萄糖。廣西每年種植甘蔗約100萬公頃，甘蔗葉作為蔗糖生產的廢棄物，約為1170萬t[2]。目前甘蔗葉主要以直接還田與焚燒為主，直接還田利用率低，肥效不高；而焚燒不僅浪費資源，還污染環境，增加二氧化碳的排放，且容易引起火災，影響航空和公路運輸安全。因此急需尋求能合理利用甘蔗葉的途徑。作者從堆肥化處理的甘蔗葉中分離出一株高效纖維素酶產生菌，并對其產酶條件進行了優化。

1 實驗

1.1 菌種

從經過堆肥化處理的甘蔗葉中篩選得到菌種。

1.2 培養基[3～5]

初篩培養基(纖維素剛果紅培養基)：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaCl 0.2 g，剛果紅0.20 g,瓊脂14 g，水1000 mL，pH值自然。

復篩培養基(CMC-Na培養基)：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42.0 g，NaCl 0.2 g，剛果紅0.20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂16 g,水1000 mL，pH值自然。

種子培養基(PDA培養基)：馬鈴薯200 g,蔗糖20 g，水1000 mL，pH值自然。

液體發酵培養基(CMC-Na培養基)：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨10 g，水1000 mL，pH值自然。

1.3 標準曲線的繪制[6]

以標準葡萄糖溶液的濃度為橫坐標、OD值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線，擬合線性方程為：y=6.8488x+0.0674。

1.4 纖維素酶產生菌的篩選

采集的樣品按照常規稀釋。將稀釋倍數分別為104、105、106的樣品溶液涂布到纖維素剛果紅培養基上，30 ℃培養3 d,劃線分離四周有透明水解圈的菌株，然后純培養。將純化后的菌株用滅菌牙簽點種到纖維素剛果紅培養基上，30 ℃培養3 d。根據水解圈直徑(H)與菌落直徑(C)比值(H/C)的大小進行初選。將初選的菌株接種于10 mL種子培養基中，30 ℃培養24 h，然后以3％(體積比)的接種量接種到液體發酵培養基中，30 ℃、160 r·min-1條件下培養3 d，測定其酶活力，選取酶活較高的菌株接種于復篩培養基上，選取酶活最高的菌株作為進一步研究的對象。

1.5 產酶條件的優化

將復篩獲得的菌株接種于初始pH值為8的液體發酵培養基中，在30 ℃、160 r·min-1條件下培養72 h，測定酶活。

分別對培養時間、培養溫度、培養基初始pH值以及接種量等因素進行優化。

1.6 粗酶液的制備

取新鮮發酵液10 mL,4000 r·min-1下離心10 min，過濾，靜置，上清液即為粗酶液。

1.7 酶活力的測定

移取0.5 mL含有1％ CMC-Na的液體發酵培養基于試管中,加入0.5 mL粗酶液,于55 ℃水浴保溫10 min后，加入2.0 mL 3,5-二硝基水楊酸終止反應,煮沸10 min,取1 mL溶液稀釋10倍,用722型分光光度計于540 nm波長下比色，對照葡萄糖標準曲線換算成葡萄糖質量。

酶活力單位(U)定義：在上述條件下,每毫升粗酶液反應1 min生成1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶產生菌的篩選

經過平板分離，挑取透明圈較大的菌株。選取酶活力最高的菌株，命名為GXU-1，根據其菌落形態初步判斷其屬于霉菌。

2.2 產酶條件的優化

2.2.1 培養時間對酶活力的影響(圖1)

圖1 培養時間對酶活力的影響

由圖1可知，隨著培養時間的延長，酶活力增大，即菌株產酶能力增強；當培養時間為72 h時，酶活力最高；培養時間超過72 h后，酶活力下降。因此，確定其最優培養時間為72 h。

2.2.2 培養溫度對酶活力的影響(圖2)

圖2 培養溫度對酶活力的影響

由圖2可知，隨著培養溫度的升高，酶活力增大，即菌株產酶能力增強；當培養溫度為30 ℃時，酶活力最高；培養溫度超過30 ℃后，酶活力下降。因此，確定最優培養溫度為30 ℃。

2.2.3 培養基初始pH值對酶活力的影響(圖3)

圖3 培養基初始pH值對酶活力的影響

由圖3可知，隨著培養基初始pH值的增大，酶活力增大，即菌株產酶能力增強；當初始pH值為8時，酶活力最高；初始pH值超過8后，酶活力下降。因此，確定最優培養基初始pH值為8。

2.2.4 接種量對酶活力的影響(圖4)

圖4 接種量對酶活力的影響

由圖4可知，隨著接種量的增加，酶活力增大，即菌株產酶能力增強；當接種量為3％時，酶活力最高，為90.19 U·mL-1；接種量超過3％后，酶活力變化不大，略有下降。

已報道的纖維素酶產生菌的酶活力一般較低，如盧月霞等[7]篩選的一株纖維素酶產生菌，其酶活力最高為44.76 U·mL-1；胡丹等[8]篩選的一株纖維素酶產生菌，其酶活力最高為75.72 U·mL-1，均低于作者篩選的纖維素酶產生菌GXU-1的酶活力。可見GXU-1是一株酶活力比較高的產纖維素酶優勢菌株。如采用適當的方法對其進行誘變處理，該菌株的產酶能力可能還會有所提高。

3 結論

從甘蔗葉堆肥中分離出一株產纖維素酶能力較強的霉菌GXU-1，并對其產酶條件進行了初步研究。確定菌株的最佳產酶條件為：培養時間72 h、培養溫度30 ℃、培養基初始pH值8、接種量3％，在此條件下，其酶活力達90.19 U·mL-1。

參考文獻：

[1]Gou P，Wang X F，Zhu W B，et al.Degradation of corn stalk by the composite microbial system of MC1[J].J Environ Sci，2008，20(1):109-114.

[2]譚裕模，黎煥光，許樹寧，等.蔗田農業廢棄物資源化利用對土壤養分的影響[J].中國糖料,2010,(1):1-4，9.

[3]樸哲,崔宗均,蘇寶琳，等.高效穩定纖維素分解菌復合系MC1的酶活特性[J].中國農業大學學報,2003,8(1):59-61.

[4]李振紅,陸貽通.高效纖維素降解菌的篩選[J].環境污染與防治，2003,25(3):5-7.

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[6]陳鈞輝.生物化學實驗(第四版)[M].北京:科學出版社，2008:73-74.

[7]盧月霞,宋惠月,劉凱楠,等.一株纖維素降解菌的篩選及其產酶條件優化[J].湖北農業科學,2010,49(1):95-97.

[8]胡丹,劉霞,雷頡.高產纖維素酶青霉菌的篩選及產酶條件的研究[J].中國食品添加劑,2007,14(2):80-84.