HTPP-MDC原核表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達

盧雪梅，黃演婷，金小寶，汪 潔，朱家勇

(1.廣東藥學院 藥用生物活性物質研究所,廣東 廣州 510006;2.廣東省生物活性藥物研究重點實驗室,廣東 廣州 510006)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV) 主要在肝細胞內寄生和復制，導致急慢性乙型肝炎的發生，甚至引起肝硬化和肝癌[1]，目前臨床上用于抗HBV的藥物無組織和器官選擇性，療效不夠理想。作者在前期研究中將肝靶向穿膜肽(Hepatocyte-targeting and penetrating peptide，HTPP)與家蠅抗菌肽天蠶素(Muscadomesticacecropin，MDC)融合，構建的肝靶向穿膜融合多肽 HTPP-MDC有望成為定位準確、高效結合、競爭性阻斷和靶向殺傷的新型抗HBV藥物，對降低乙型肝炎病毒感染引起的肝臟疾病的發病率和死亡率具有深遠的意義。

但如何低成本、大量獲得多肽類藥物以滿足其開發與應用的需求是科研工作者積極探索的課題。目前，多肽類藥物的來源主要有以下幾種：(1)直接從生物體分離純化，由于數量太少且成本太高，作為應用開發幾乎是不可能。(2)根據蛋白質的氨基酸序列，進行人工合成，也存在成本高、活性低等一系列問題[2]。(3)利用基因工程技術生產，該領域的飛速發展為低成本多肽類藥物生產提供了一種可持續方案。通過基因重組技術，可大量高效地生產多種生物活性多肽如干擾素、生長因子等，在腫瘤、乙肝、神經系統疾病、創傷以及艾滋病等治療領域得到了廣泛應用[3]。

作者在此利用基因重組技術將目的基因亞克隆入原核表達載體pET32a(+)中，構建重組原核表達質粒，通過大腸桿菌表達，采用 SDS-PAGE 和 Western blot 對表達產物進行檢測與鑒定，擬為HTPP-MDC的生物學活性研究及產業化開發奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

宿主菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)，質粒HTPP-MDC/pMD20-T，自行保存；質粒pET32a(+)，Novagen公司；限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ、T4DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、DNA分子量標準，TaKaRa公司；TIANgel Midi Purification Kit、TIANpure Midi Plasmid Kit，北京TIANGEN公司；蛋白質分子量標準，Fermentas公司；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS，Sigma公司；TEMED，北京鼎國生物公司；6×His Tag小鼠單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體，美國Pharmacia公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司；其它化學試劑為進口或國產分析純。

1.2 表達載體的構建

以質粒HTPP-MDC/pMD20-T為模板，用上游引物P1:5′-CGGGGTACCGACGACGACGACAAGAA-TAGTCGTTCACTTG-3′和下游引物P2:5′-CCC-AAGCTTATTAGTTACCCTTTAATGTGGCGGC-A3′(下劃線為酶切位點，粗斜體為腸激酶酶切位點) PCR擴增出目的基因。將獲得的PCR片段和表達載體pET32a(+)分別用限制性內切酶KpnⅠ 和HindⅢ進行雙酶切，回收酶切產物后，用T4DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化E.coliBL21(DE3)，轉化菌種涂于含有氨芐青霉素的平板，培養16～18 h后，挑取單菌落培養后進行菌液PCR、酶切鑒定及DNA測序驗證。

1.3 融合基因的誘導表達及表達產物鑒定

將純化的HTPP-MDC/pET32a質粒轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，經氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落于5 mL LB液體培養基(1％的蛋白胨，0.5％的酵母抽提粉，85 mmol·L-1的氯化鈉)中，37 ℃、220 r·min-1培養8～12 h，然后將此菌液按1∶100比例接種到新鮮的LB液體培養基中，37 ℃、220 r·min-1培養至OD600=0.6時，加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG誘導4～6 h，離心收集菌體，進行15％ SDS-PAGE電泳。

將收集的菌體重懸于0.1 BV預冷的細菌裂解液(0.2 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，25 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.0)中，在超聲波破碎儀下破碎12 min(功率250 W，開6 s，停6 s)，然后于4 ℃、14 000 r·min-1下離心30 min，分別取上清和沉淀進行15％ SDS-PAGE，分析表達產物的可溶性。

IPTG誘導后的表達產物經15％的SDS-PAGE電泳后通過半干電轉儀轉移至硝酸纖維素膜(Polyvinylidene difluoride，PVDF)上，以6×His Tag小鼠單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，用DAB顯色系統顯色，檢測分析Western blot結果。

2 結果與討論

2.1 表達載體的構建

用PCR方法從HTPP-MDC/pMD20-T質粒中擴增目的基因HTPP-MDC，片段長度為220 bp，凝膠電脈檢測其大小與預期一致(圖1)。經KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后產生含有目的基因的DNA片段，定向插入經KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的含有6×His的pET32a(+)表達載體中，從而構建重組質粒HTPP-MDC/pET32a(圖2)。在含有氨芐青霉素的平板上挑取重組質粒HTPP-MDC/pET32a轉化后的E.coliBL21單菌落培養并進行菌液PCR，初步鑒定為陽性的克隆搖菌提取質粒進行KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，結果表明重組質粒經KpnⅠ/HindⅢ雙酶切出與預期大小一致的條帶(圖3)，驗證的質粒經DNA測序分析，無堿基錯配，最終確定重組表達質粒HTPP-MDC/pET32a構建成功。

M.DL2000 DNA Marker 1.HTPP-MDC PCR擴增產物

圖2 HTPP-MDC/pET32a重組質粒圖譜

M1/M2.DL2000/DL10 000 DNA Marker 1.重組質粒的PCR鑒定 2.經Kpn Ⅰ、Hin dⅢ雙酶切的重組質粒

2.2 融合基因的誘導表達及表達產物的鑒定

將構建成功的重組表達質粒轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，誘導4～6 h后取樣，經15％ SDS-PAGE電泳檢測在大小約25 kDa處出現蛋白條帶，而未誘導的菌體蛋白未出現相應的條帶(圖4)。這是因為，載體pET32a(+)具有Trx標簽，蛋白分子量約為18 kDa，而HTPP-MDC分子量約為7 kDa，因此表達的蛋白分子量約25 kDa。超聲破碎后離心取上清和沉淀進行15％ SDS-PAGE分析，結果顯示：表達蛋白主要存在上清中，為可溶性表達(圖4)。

M.蛋白質分子量標準 1，2.E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC誘導前和誘導后 3，4.E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC誘導后裂解液上清和沉淀

由于融合蛋白含有pET32a(+)編碼的6×His標簽，采用鼠源His單克隆抗體為一抗進行Western blot，結果顯示誘導后的含重組質粒表達菌株在25 kDa處有一條特異性條帶而未誘導的沒有，進一步證實了表達的蛋白為帶有His標簽的融合蛋白(圖5)。

M.蛋白質分子量標準 1，2.E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC誘導前和誘導后全菌蛋白

2.3 討論

大腸桿菌表達系統具有培養周期短、成本低廉、目的基因表達水平高等特點，是生物技術研究和生物藥物產業化進程中的重要工具。但如果表達的生物活性多肽本身具有抗菌活性，則對表達宿主菌具有殺傷作用，即所謂工程菌表達“毒性”蛋白時出現“自殺”現象，其直接表達較困難。另外，利用基因工程技術表達小分子多肽時，產物容易降解，得率較低。因此，表達這類多肽時采用融合表達方式較為理想。應用原核表達系統表達后，通過工具酶切除融合標簽，可得到具有天然活性的重組多肽[4]。

本研究采用的原核表達載體為pET32a(+)，它是一種帶有T7噬菌體Lac強啟動子的原核高效融合表達載體，載體中的硫氧還原蛋白標簽(Trx Tag)和外源基因一同表達，不僅能增強融合表達蛋白的溶解性，而且在保護融合蛋白免受蛋白酶降解時也起到一定作用[5]。但標簽蛋白會在一定程度上影響目的蛋白的生物學活性，所以在很多時候需要將標簽蛋白切除[6]。常用酶切割的方法切除標簽蛋白[7，8]，其中腸激酶最為常用。pET32a(+)載體中本身帶有一個腸激酶酶切位點，但如果利用其本身的這個腸激酶酶切位點，由于限制性內切酶位點的存在，酶切后的目的蛋白會在N端引入不必要的氨基酸殘基，有可能對目的蛋白的功能產生一定的影響。因此，本研究在構建重組表達質粒時，在目的基因前加入了編碼腸激酶酶切位點的核苷酸序列，表達出來的融合蛋白經腸激酶酶切后產生目的蛋白的天然N末端，從而保證了目的蛋白的完整性和真實性。

3 結論

通過雙酶切、連接、轉化等方法成功構建了融合表達質粒HTPP-MDC/pET32a，轉化E.coliBL21(DE3)，經IPTG誘導，SDS-PAGE分析表明重組融合蛋白為可溶性表達，Western blot雜交證實了表達蛋白的抗原活性。為HTPP-MDC后續的生物學活性研究及產業化開發應用奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Kew M C.Epidemiology of chronic hepatitis B virus infection，hepatocellular carcinoma，and hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma[J].Pathol Biol(Paris),2010，58(4):273-277.

[2]Hancock R E，Patrzykat A.Clinical development of cationic antimicrobial peptides：From natural to novel antibiotics[J].Curr Drug Targets Infect Disord,2002，2(1):79-83.

[3]Goeddel D V，Heyneker H L，Hozumi T，et al.Direct expression inEscherichiacoliof a DNA sequence coding for human growth hormone[J].Nature,1979，281(5732):544-548.

[4]Lu X M，Jin X B，Zhu J Y，et al.Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme inEscherichiacoli[J].Appl Microbiol Biotechnol，2010，87(6)：2169-2176.

[5]Zhou L，Zhao Z，Li B，et al.TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes inEscherichiacoli[J].Protein Expr Purif,2009，64(2):225-230.

[6]Erturk-Hasdemir D， Broemer M， Leulier F， et al. Two roles for theDrosophilaIKK complex in the activation of Relish and the induction of antimicrobial peptide genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009，106(24):9779-9784.

[7]Huang L，Leong S S，Jiang R.Soluble fusion expression and characterization of bioactive human beta-defensin 26 and 27[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009，84(2):301-308.

[8]Huang L，Ching C B，Jiang R，et al.Production of bioactive human beta-defensin 5 and 6 inEscherichiacoliby soluble fusion expression[J].Protein Expr Purif,2008，61(2):168-174.