血管活性腸肽的固相合成及其體外抗菌活性研究

徐春蘭,尚曉婭，牛衛(wèi)寧，欽傳光

(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點實驗室，陜西 西安 710072)

抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性(抗細菌、病毒和真菌)的小分子量的陽離子蛋白質(zhì)[1]；而神經(jīng)肽是一類在調(diào)節(jié)神經(jīng)源性炎癥中發(fā)揮重要作用的神經(jīng)遞質(zhì)[2]，具有與抗菌肽相似的大小、電荷、等電點和氨基酸組成，從而表現(xiàn)出直接的抗菌效應(yīng)。神經(jīng)系統(tǒng)可能將作為抗菌劑的神經(jīng)肽快速準確地遞送到神經(jīng)支配的位點如口腔。研究表明，神經(jīng)肽如P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A(NKA)、人降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、神經(jīng)肽Y(NPY)和血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)等存在于人正常和齲壞牙齒的牙髓、齦溝液和唾液中[3～5]。

VIP，又名舒血管腸肽，為直鏈肽，屬胰高血糖素-胰泌素家族，在人體內(nèi)分布較廣，不僅是胃腸道激素，同時又是一種神經(jīng)肽。許多免疫活性細胞不僅能釋放少量的VIP，而且其表面上也有與VIP高親和力的受體存在。研究表明，VIP是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間相互作用的一種信號分子，在機體免疫、尤其是在局部粘膜免疫中起著一定的作用；VIP對消化道運動起抑制性調(diào)節(jié)作用；VIP可以直接殺死各種細菌和酵母菌，是一種潛在的抗菌肽[6～8]。因此，研究VIP的合成及活性意義重大。

作者采用Na-芴甲氧羰基(Fluorenylmethyloxyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC)作為α-氨基的保護基，以固相合成法合成VIP，并對其體外抗菌活性進行了評價。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

受試菌株：大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)、變形鏈球菌(StreptococcusmutansATCC 25175)、糞腸球菌(EnterococcusfaecalisATCC 29212)、銅綠假單胞桿菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)和嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC 4356)，中科院微生物研究所；人牙齦纖維原細胞系(Human gingival fibroblasts，HGF)，上海麥莎生物科技有限公司；抗菌肽Cecropin,Sigma公司。

MHB、SB、MRS培養(yǎng)基，中國進出口商品檢驗技術(shù)研究所；MEM培養(yǎng)基：L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素。

Fmoc-氨基酸、2-(1H-苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、N，N′-二異丙基乙胺(DIEA)、Fmoc-His(Trt)-Wang樹脂，上海吉爾生化公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)、哌啶(PIPE)、三氟乙酸(TFA)，均為國產(chǎn)分析純；乙腈(ACN)，色譜純，F(xiàn)isher公司。

旋轉(zhuǎn)混合儀；Bio-Spin空柱；高效液相色譜儀，美國Waters公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)，美國Linear Scientific公司；酶標儀，美國Biotex公司。

1.2 血管活性腸肽的合成

1.2.1 樹脂的溶脹

稱取2 g Fmoc-His(Trt)-Wang樹脂，加入NMP 20 mL，溶脹樹脂2 h。加入20 mL DCM，混勻1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。加入20 mL 20％ PIPE，反應(yīng)30 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)1次。加入20 mL DCM，混勻1 min，清空反應(yīng)器，再加入20 mL NMP，混勻 1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。

1.2.2 肽鏈的合成

向溶脹好的樹脂中加入1 g Fmoc-His-OH、1 g HBTU(用5 mL NMP溶解)、3 mol·L-1的DIEA溶液40 μL，混勻后加入到反應(yīng)器中，再加入15 mLNMP反應(yīng)2 h。清空反應(yīng)器，加入20 mL DCM，混勻1 min，清空反應(yīng)器，再加入20 mL NMP，混勻1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。加入20 mL 20％ PIPE，反應(yīng)30 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)1次。加入DCM 20 mL，混勻1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。

采用相同的操作步驟，依次縮合Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(Boc)-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-IIe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。

1.2.3 切肽

在最后形成的多肽樹脂中，加入切割液TFA，反應(yīng)4 h，用砂芯漏斗過濾，收集濾液，用冰乙醚離心沉淀，凍干，即得VIP。

1.3 高效液相色譜分離和質(zhì)譜測定

用高效液相色譜儀進行粗肽的分離。色譜柱為C18柱，檢測波長210 nm。洗脫液 A：0.05％ TFA+2％ ACN；B：0.05％ TFA+90％ ACN。線性梯度由0％ B溶液→30％ B溶液，時間30 min，流速1.0 mL·min-1。對收集的主峰進行質(zhì)譜測定。

1.4 體外抗菌活性測定

采用瓊脂糖彌散抗菌實驗[9]檢測VIP對各種病原菌的抗菌活性，以100 μg·mL-1抗菌肽Cecropin作為陽性對照。

取實驗用病原菌于50 mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，E.coli、S.aureus、S.mutans、E.faecalis、P.aeruginosa用MHB培養(yǎng)基，C.albicans用SB培養(yǎng)基，L.acidophilus用MRS培養(yǎng)基。接種50 μL過夜培養(yǎng)基于50 mL合適的新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，獲得對數(shù)生長中期的病原菌。病原菌于4 ℃、1000×g離心10 min后，用10 mmol·L-1PBS(pH值7.4)漂洗，懸浮在10 mL的PBS中。制備襯底凝膠，其中含有1％的瓊脂、5×106個細菌細胞。通過渦旋分散微生物，倒入培養(yǎng)皿中。凝固后用打孔器在瓊脂上打孔洞(直徑2.5 mm)，然后向每個孔加入3 μL的VIP溶液(濃度范圍50～500 μg·mL-1)，陰性對照孔用無菌水代替。將培養(yǎng)皿置于37 ℃、好氧條件下培養(yǎng)3 h，使肽擴散。然后將10 mL 1％的瓊脂上層凝膠(含有細菌特定培養(yǎng)基)倒入上述培養(yǎng)皿以提供病原菌生長所需要的營養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)18 h，用考馬斯亮藍G-250稀釋液染色。

用放大鏡(放大8倍)觀察抑菌圈，抑菌圈的直徑以單位U表示(1 U=0.1 mm)，需減去中心孔的直徑。

抗菌活性以最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)表示，而MIC值以x軸截距(由自由彌散單位與log10×肽的濃度的關(guān)系曲線得到)來確定。當MIC>500 μg·mL-1時被定義為耐藥性，MIC取3次獨立實驗分析平均值。

1.5 對人正常細胞活性的影響

通過MTT實驗評價VIP對人正常細胞的毒性。

將HGF接種于96孔培養(yǎng)板，加入MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。加入100 μL 100 μg·mL-1的VIP培養(yǎng)3 h，VIP未處理孔為空白對照組。吸棄培養(yǎng)液，迅速加入 10 μL 5 mg·mL-1的四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，取出培養(yǎng)板，小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，于37 ℃培養(yǎng) 10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標儀測定各組細胞在570 nm處的吸光度(A)值。按下式計算細胞存活率：

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜分析(圖1)

圖1 血管活性腸肽的HPLC圖譜

從圖1可知，主峰面積較大，其它峰面積與主峰面積相比較小，表明合成的VIP雜質(zhì)少、純度高。根據(jù)HPLC譜圖中峰面積計算，VIP純度達到95.2％。

2.2 質(zhì)譜鑒定(圖2)

圖2 血管活性腸肽的質(zhì)譜圖

從圖2可知，實際合成的VIP相對分子質(zhì)量為3326.5，與VIP的理論分子質(zhì)量3326.5一致。圖2中主峰明顯，說明合成的VIP經(jīng)色譜儀純化后，可以除去大部分的雜質(zhì)，得到較純的VIP。

2.3 體外抗菌活性分析

固相合成的VIP對幾種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的體外抑制作用見表1。

表1 血管活性腸肽對不同受試菌的最小抑菌濃度/μg·mL-1

由表1可知，VIP對病原微生物E.coli、P.aeruginosa、C.albicans和S.mutans表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性，其中對E.coli、P.aeruginosa的抑制效果較明顯。陽性對照組(100 μg·mL-1Cecropin)能有效地抑制各種受試微生物(E.faecalis除外)，而陰性對照組(無菌水)無抗菌活性。

2.4 血管活性腸肽對細胞存活率的影響(圖3)

圖3 血管活性腸肽對人牙齦纖維原細胞存活率的影響

由圖3可知，VIP對人正常細胞系HGF的活性無影響，在作用濃度為100 μg·mL-1時，HGF細胞的存活率為93％。

2.5 討論

本研究采用FMOC固相方法合成VIP，粗肽經(jīng)過純化和分離得到預(yù)期活性產(chǎn)物。選用Fmoc-His(Trt)-Wang樹脂為合成的起點，將VIP羧端固定在樹脂上，向氨基端逐步遞加、延長肽鏈，每一步反應(yīng)均較易進行，消旋化的可能性小，但要求每步反應(yīng)都達到高產(chǎn)率。目標肽的粗品經(jīng)高效液相色譜分析純度為95.2％，質(zhì)譜分析其相對分子質(zhì)量為3326.5，與理論值一致。由于多肽是用固相法合成的，氨基酸的連接順序固定，證明了合成的VIP結(jié)構(gòu)正確。

神經(jīng)肽在神經(jīng)性炎癥和疼痛方面起重要作用，還參與免疫調(diào)節(jié)[10]。越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)肽通過直接的抗菌作用在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[6]。已有報道神經(jīng)肽對來自皮膚、口腔、呼吸道和胃腸道的一系列微生物都有抗菌活性。作者首次報道固相合成的VIP對病原菌E.coli和P.aeruginosa具有較強的抗菌作用。在口腔組織中，神經(jīng)肽在調(diào)節(jié)神經(jīng)性炎癥中發(fā)揮著重要的作用。對于細菌引起的炎癥狀態(tài)如牙髓炎和牙周炎，常常可觀察到神經(jīng)肽表達量的上調(diào)[3～5]。神經(jīng)肽在齲齒附近牙髓的成牙質(zhì)細胞層和成牙質(zhì)細胞下層的萌芽[5]，導(dǎo)致炎癥部位神經(jīng)肽水平的提高，從而發(fā)揮直接的抗菌作用。研究還表明，即使在濃度為100 μg·mL-1時，在瓊脂糖彌散抗菌實驗中具有抗菌活性的VIP對人正常細胞的細胞毒性仍有限，支持其在選擇性地殺傷細菌方面的生理作用。

一些種屬的細菌如L.acidophilus、E.faecalis和S.aureus對VIP的抗菌效應(yīng)表現(xiàn)出耐受性。目前這些耐受性還不能解釋清楚，但是S.mutans顛覆陽離子抗菌肽的能力被認為是細胞表面靜電作用的改變使得其凈負電荷減少，導(dǎo)致其和陽離子抗菌肽結(jié)合力的降低[11]。

神經(jīng)肽和抗菌肽在分子大小、氨基酸組成、兩親性設(shè)計和陽離子電荷方面的相似性支持了神經(jīng)肽能作為抗感染分子的假說[6]。研究表明，VIP對E.coli和P.aeruginosa的抗菌活性可以與已經(jīng)報道的抗菌肽α-防御素相比[12]。本實驗結(jié)果中神經(jīng)肽的體外抗菌活性譜也表明其調(diào)節(jié)內(nèi)在免疫應(yīng)答的潛力。由于抗菌肽體內(nèi)活性受到pH值、離子濃度、與蛋白質(zhì)和糖胺聚糖的結(jié)合力等因素以及[13]體內(nèi)生理性相互作用的影響，有必要進一步深入研究。神經(jīng)肽可能的相互協(xié)同作用及其對臨床分離菌株的活性作用的研究將有助于開發(fā)其作為新的治療劑的潛力。

3 結(jié)論

采用Na-芴甲氧羰基(FMOC)作為α-氨基的保護基，以逐個延伸的固相合成法合成了血管活性腸肽，以最小抑菌濃度(MIC)評價其體外抗菌活性。高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明所合成的血管活性腸肽的純度為95.2％，相對分子質(zhì)量為3326.5；血管活性腸肽對幾種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有不同程度的抑制活性，其中對E.coli和P.aeruginosa的抑制效果最好。

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