葛根素通過(guò)ERK1／2信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖

唐哲明 梁國(guó)榮（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院（柳州市工人醫(yī)院）整形外科，廣西 柳州 545005）

葛根素系從豆科植物野葛或甘葛藤根中提取的一種黃酮苷。其化學(xué)名稱(chēng)為：8－β－D－葡萄吡喃糖－4’，7－二羥基異黃酮。有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、降低心肌耗氧量，改善微循環(huán)和抗血小板聚集的作用［1－3］。已有研究表明，葛根素有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用［4－9］，本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為模型，研究葛根素對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并測(cè)定p－ERK1／2蛋白的表達(dá)，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

葛根素（HPLC＞98%）購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；四甲基噻唑蘭 （MTT）購(gòu)于Invitrogen公司；磷酸化ERK1／2抗體及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC－12）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U·ml－1青霉素和100μg·ml－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC－12細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以2×104·孔－1的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100μl。繼續(xù)培養(yǎng)24h待細(xì)胞完全貼壁后，移去上層培養(yǎng)液，加入含不同濃度葛根素（1、5、10、20、40、80、160μM）的新鮮培養(yǎng)基。空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液（5mg·ml－1）20μl，孵育4h，吸去上清液，每孔加 DMSO 150 μl，避光振蕩10min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于490nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖率＝處理組OD值／對(duì)照組OD值×100%。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中。24h后，加入不同濃度葛根素（20、40、80 μM）及空白培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，1000rpm·min－1離心5min，加預(yù)冷的PBS洗滌2次后，Annexin V－FITC及碘化丙啶（PI，50μg·ml－1）室溫避光染色，15min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。總凋亡細(xì)胞率＝早期凋亡細(xì)胞率＋晚期凋亡細(xì)胞率。

1.3.3 Western Blot

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞融合至90%，加入不同濃度葛根素（20、40、80μM）及空白培養(yǎng)基處理1h后，預(yù)冷PBS洗滌，加入蛋白裂解液置于冰上裂解30min后，4℃，12000rpm·min－1離心5min，取上清液。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，95℃煮沸5min變性，行SDS－PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h。分別將膜置于p－ERK1／2及β－actin單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次后，二抗室溫孵育2h，TBST漂洗3次，ECL顯色，暗室曝光并拍照。以β－actin為內(nèi)參，用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的顯著性差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示（圖1），經(jīng)葛根素作用48h后，與空白對(duì)照組比較，80μM及以下各濃度組細(xì)胞增值率＞100%，且呈劑量依賴(lài)性。其中以20μM、40μM及80μM濃度時(shí)，促增殖作用最為明顯，增殖率分別達(dá)118.06%、135.92%及165.45%（P＜0.01）。隨葛根素濃度增加至160μM，細(xì)胞增殖受到抑制，增值率為95.1%。葛根素在較低濃度時(shí)能夠劑量依賴(lài)的促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖。

圖1 不同濃度葛根素對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響

2.2 葛根素抑制HUVEC細(xì)胞凋亡

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率，如圖2所示，與空白對(duì)照組（14.23%）比較，經(jīng)過(guò)不同濃度葛根素（20、40、80μM）處理48h后，各組細(xì)胞凋亡率分別減少到12.94%，9.63%，6.5%（P＜0.01）。

圖2 葛根素對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響

2.3 葛根素誘導(dǎo)磷酸化ERK1／2蛋白的表達(dá)

為探討葛根素促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot方法檢測(cè)經(jīng)不同濃度葛根素處理1h后磷酸化ERK1／2蛋白表達(dá)水平的改變。與空白組相比，葛根素能劑量依賴(lài)性增加ERK1／2磷酸化水平（圖3），以40μM及80μM濃度尤為明顯（P＜0.01）。

圖3 葛根素對(duì)磷酸化ERK1／2蛋白水平的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)內(nèi)循環(huán)介質(zhì)與組織間隙的機(jī)械屏障，其分泌的多種細(xì)胞因子在燒傷早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。燒傷可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能異常或凋亡，血管內(nèi)皮機(jī)械屏障被破壞，加速炎癥反應(yīng)［10－12］。因此研究藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖凋亡的影響，對(duì)于燒傷后組織的恢復(fù)具有重要意義。葛根素對(duì)HUVEC細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用，并且減少HUVEC細(xì)胞早期凋亡率。

絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）是一組可被多種信號(hào)激活的絲／蘇氨酸激酶。經(jīng)雙重磷酸化激活后可參與細(xì)胞的多種生物活性，如調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等。ERK1／2信號(hào)通路是最早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典的Ras－Raf－MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞分裂、遷移及存活。主要參與各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、絲裂原以及激素受體活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與內(nèi)皮細(xì)胞的生存、增殖［13－15］。我們的結(jié)果提示葛根素有激活磷酸化ERK1／2，呈劑量劑量依從性。因此葛根素誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的增殖，抑制其早期凋亡主要是通過(guò)ERK1／2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，考慮到葛根廣泛應(yīng)用于臨床，本研究為其提供了理論依據(jù)。

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