噬菌體治療細菌感染的研究進展

秦天呈 姚彬 王文 滕燕 孟俊杰 曾蔚

（1.四川大學華西基礎醫學與法醫學院2009級基礎醫學專業基地班，四川 成都 610041；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院微生物學教研室，四川 成都 610041）

1 噬菌體早期研究實驗

噬菌體是由英國細菌學家Twort（1915）及法裔加拿大細菌學家D’Herelle（1917）分別發現的一類細菌病毒。他們在研究中發現，噬菌體具有使宿主細菌裂解的現象，從而提出了噬菌體應用于治療的可能性［1］。早在D’Herelle發現噬菌體的當年，他就在臨床上進行了第一次噬菌體治療實驗，其有效性得到了證明，但由于此次實驗缺乏嚴格的實驗設計，因而不被科學界所認可［2］。而后，D’Herelle又用直接注射的方法使四名患有鼠疫的病患全部康復［3］。早期的噬菌體研究主要集中在蘇聯和東歐，但由于抗生素的出現和世界政治格局的變化，噬菌體的研究逐漸停滯不前。

六十年代末，我國醫學工作者用噬菌體治療燒傷引起的銅綠假單胞桿菌感染，取得了很好的效果［4］，七八十年代以來，西方國家大量的動物實驗也讓人們深刻的意識到：噬菌體作為抗感染生物制劑，在臨床上的應用是有一定前景的［5，6］，甚至可能作為繼抗生素之后，人類對抗細菌感染的又一有效武器。

2 噬菌體的當代研究狀況

近年來，隨著抗生素的治療效果日趨下降，耐藥菌種的不斷出現，世界各地的研究人員又將目光重新聚集到了噬菌體的身上。使噬菌體不僅在抗感染的治療中發揮巨大作用，在臨床的各種檢測中也作出了卓越的貢獻。2003年，美國就發現第一例抗萬古霉素的金葡，而在利用小鼠模型作為檢驗應用噬菌體治療效果時，顯示了噬菌體具有顯著的保護作用［7］。而在2011年，巴斯德實驗室發表的關于噬菌體治療銅綠假單胞菌感染引起的肺囊性纖維化小鼠模型的實驗論文中，也證實應用噬菌體治療取得了很好的治療效果：在有效治療劑量作用下，2小時后小鼠的存活率達到95%，而在四天的正常治療劑量后，治愈率可達100%［8］。

(1)燃油管路、燃油濾清器進入空氣或阻塞按前術方法排空氣或更換燃油濾清器芯子。(2)噴油泵供油不良檢查修理或更換偶件。(3)噴油器霧化不良或油壓力低進行噴霧觀察或調整噴油壓力，并檢查噴油嘴偶件或更換。

3 噬菌體殺菌機制及特點

噬菌體有嚴格的宿主特異性，不能感染人體內的細胞，僅寄居在易特異宿主菌體內。噬菌體具有高度的特異性，一種噬菌體往往只侵染一種細菌，或只侵染某一菌株。按生活周期可將噬菌體可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。侵入宿主細胞后，引起宿主菌快速裂解的噬菌體被稱作烈性噬菌體。另一種稱為溫和噬菌，其侵入宿主細胞后，可以出現兩種反應，一種是與烈性噬菌體相同的裂解反應，另一種則是以前噬菌體的形式附著并整合在宿主菌的染色體上，使宿主菌不裂解而繼續生長，表達病毒基因。從噬菌體治療的角度考慮，溫和噬菌體的可利用價值不高，故通常提到的噬菌體為烈性噬菌體。

噬菌體制劑通過離心就可以去除細菌碎片得到純化，易于保存和運輸。且從進化的觀點來看，完全可以通過自然選擇來篩選噬菌體治療耐藥或耐噬菌體的細菌感染，這是抗生素所無法比擬的。

第三，形成了一些比較有效的課堂規范，但也有一些課堂規范阻礙了學生的自由發展.張老師經過多年的教學實踐，形成了自己的一套課堂教學規范.如一個學生在回答問題時，要求其他學生保持安靜，待這位學生講完后再發表意見.這樣的課堂規范，有利于養成學生學會傾聽，并對他人的觀點進行思考的習慣.但是還有一些課堂規范不利于學生的自由發展，如要求學生想到解答方法或獲得答案后不能隨便發言，等老師點名后才可以回答；再如，要求學生統一解題思路后，再動手做題.

其中:x(t)=(x1(t),x2(t),…,xN(t))T為N 維狀態向量;u(t)=(u1(t),u2(t),…,um(t))T為控制向量;mN；f(x(t),u(t),t)=(f1(x(t),u(t),t),f2(x(t),u(t),t),…,fN(x(t),u(t),t))T為N維實值函數向量.為了研究問題的方便,引入廣義狀態空間的概念.

工序加工能耗包括工序加工過程中的切削過程能耗、空切過程能耗、工件裝夾過程能耗和磨頓換刀過程能耗[11]。因此，調度過程中的工序加工能耗

3.1 吸附識別和穿入

抗生素多數是以破壞致病菌與非致病菌為目標的廣譜性藥物，因而很可能破壞機體或目標環境的菌群平衡，從而導致嚴重的二次感染。傳統抗生素治療在殺滅致病菌的同時，也破壞了消化道及泌尿生殖道等部位的正常菌群，從而導致菌群失調，引起機會性感染甚至更嚴重的全身性感染。而噬菌體擁有嚴格的宿主特異性［11］，只針對相應的宿主菌，而不會破壞正常菌群，避免二次感染。

3.2 溶菌

通過對噬菌體的溶菌基因及溶菌過程的研究初步認為，噬菌體對其宿主菌的溶解是由專一溶解基因編碼的特異性蛋白或噬菌體自身蛋白介導的溶解系統統一完成的，這一溶解系統具有一套完整、精密的調節機制和控制體系，而且其作用基質多集中宿主菌的細胞壁上，噬菌體蛋白通過不同的途徑影響和破壞宿主菌胞壁質的生物合成及正常結構，從而導致噬菌體宿主菌細胞損傷、死亡。

噬菌體對細菌的感染效率驚人，重復4個感染周期后，一個噬菌體顆粒可殺滅數10億個細菌，這是噬菌體極具特色的一種生物學特性。由于具備強大的殺菌能力，噬菌體在治療細菌感染、消毒以及反生物武器等領域具有良好應用前景。

4 噬菌體作為治療性制劑的優勢

抗生素作為上個世紀發現的藥物，隨著大量的生產和使用，對細菌造成了選擇性的壓力，在我國及世界各地都接連發現了耐藥的、甚至是多重耐藥的超級細菌，給臨床治療帶來了極大的困難［10］。而噬菌體作為更早發現的生物制劑，雖然目前的研究還不夠成熟，但在面對細菌選擇性和針對細菌專一性方面都具有明顯的優越性。

4.1 噬菌體殺菌有嚴格的宿主特異性，不會破壞正常菌群

不同的噬菌體吸附宿主菌的部位是不同的，通常噬菌體的尾端吸附于細菌的表面，有尾噬菌體多以尾絲吸附宿主菌的外膜蛋白，另外，噬菌體能否吸附于菌株主要取決于該特異宿主細胞是否具有噬菌體的結合受點，不同的噬菌體受點位于細胞壁的層次不盡相同，大多數噬菌體如λ噬菌體和P22噬菌體則吸附于細菌的細胞壁組分，例如磷壁酸或多糖（革蘭氏陽性菌），脂多糖或蛋白質（革蘭氏陰性菌），絲狀噬菌體則多吸附于細菌的性菌毛上。噬菌體的穿入是個極其快速的過程，但速率明顯受到溫度、結構、及其他理化因子的影響。

4.2 噬菌體治療效果不因細菌耐藥性而改變

一些在某些情況下對宿主菌具有較強裂解作用的噬菌體，在某些特定條件下會發生轉變，其基因組在進入宿主菌體后不表達溶菌物質，而是整合到宿主菌基因組上，成為溶原性噬菌體，不但不適用于臨床治療，更有可能使宿主菌獲得毒力因子。

因為前面幾次班級活動都是學生自己策劃的，所以，今年的班級生日會，我完全放手讓學生操辦，我只作為顧問幫助策劃者排憂解難。在籌劃過程中，小蝶作為主負責人，經常詢問我生日會的環節是否合適。

4.3 噬菌體治療的效率高

根據抗生素的藥代動力學，抗生素會進入機體的新陳代謝，并且最終被排出體外，不能集中在感染部位，而噬菌體只在感染部位增殖，并且增殖很快，只需極少量的噬菌體就可以完成大量殺滅細菌的工作。

4.4 噬菌體治療的副作用少

很少有噬菌體治療引起嚴重副反應的報道，偶爾可出現輕微的細菌內毒素反應，但都在可控制的范圍之內。Bruttin等［14］讓一些健康的志愿者口服純化后的T4噬菌體制劑，與對照組相比，未見不良的癥狀，并且足夠的證據證明：用噬菌體治療細菌性感染是很安全的，即使是一些存在免疫缺損的病人服用噬菌體制劑也無異常癥狀。

4.5 噬菌體制劑研發所需的時間短，成本低

五六十年代，濟寧林業遭受很大破壞，森林資源持續減少。隨后全國迎來了改革開放，濟寧開始大規模推進國土綠化，通過完善造林綠化政策、簽訂綠化目標責任狀、實施工程造林等多種措施，造林綠化穩步推進，森林資源持續增長，截至目前，全市林木綠化覆蓋率達到32.21%。

5 噬菌體治療面臨的問題

5.1 引發免疫反應

噬菌體本身具有較強的免疫原性，進入人體后會受到免疫系統攻擊。雖然噬菌體在到達感染部位并識別宿主細菌后能迅速產生裂菌作用，但相當數量的噬菌體在循環系統內就已經被固有免疫系統所攔截，并失去活性，這就使靜脈注射噬菌體的效率大為降低。馬曉麗等人檢測了M13噬菌體在血液中的殘余活性時間梯度，發現活性噬菌體的數量在注射入血后的數量隨時間驟降，5min后剩余約50%，15min時已減少至不到20%。同時該研究組認為，血清中存在的因子可能是導致噬菌體失活的主要因素，且很可能是由IgM介導的補體所引發［15］。

噬菌體基因組中包含有改變細菌致病性的片段，使得溶原性轉化的宿主細菌產生一系列表型變化，導致細菌出現毒性或毒性增強，例如白喉棒狀桿菌產生白喉毒素，以及C型和D型肉毒梭菌產生肉毒神經毒素。

5.2 鑒別溫和噬菌體與烈性噬菌體

噬菌體與抗生素的作用機制完全不同，治療效果不因細菌耐藥性而改變。所以他們能夠有效的治療那些由耐藥性細菌所引起的疾病。Carlon［12］指出，細菌對抗生素產生抗性的突變頻率是10－6，而對噬菌體產生抗性的突變頻率為10－7，聯合用藥的雙突變率降為10－13。并且噬菌體可產生一定程度的變異用以適應宿主菌的變異，傳統抗生素則不具備這種優勢。Biswas等在2002年曾經報道過，他們運用噬菌體成功地治療了感染了耐萬古霉素屎腸球菌（Vancomycinresistant Enterococcus faecium，VRE）的小鼠［13］。

5.3 藥物動力學特征復雜

與傳統化學藥物相比，噬菌體的藥物代謝動力學特征更為復雜。由于噬菌體具有獨特的增殖方式及免疫原性，其在體內的代謝情況除與噬菌體種類有關外，還受到細菌數量及代謝狀態、人體免疫系統的影響，不同噬菌體具有不同的藥物動力學特征，噬菌體的體外生長數據也不能直接運用到體內［16］，因而造成給藥時機和劑量不易把握的困難。

5.4 細菌對噬菌體的抗性問題

噬菌體的宿主菌可能會通過突變獲得對噬菌體的抗性，這點與細菌對抗生素產生耐藥突變相似。雖然這一轉變發生的頻率遠低于耐藥突變，但仍然有可能成為噬菌體治療中的一大困難。

所有真細菌的噬菌體最終都是以裂解宿主細胞的方式來終止營養周期，釋放子代病毒。一般噬菌體對細菌的破壞分兩步進行［9］：

5.5 噬菌體攜帶的毒力因子

After the tensile experiment, the relationship of tensile force and distance is shown as Figure 3.

美國作家張純如不這么看。張純如26歲那年，在美國斯坦福大學，參加了一次紀念南京大屠殺遇難者的追思會。會上，張純如被南京大屠殺血腥的歷史圖片震驚。那些“毫無掩飾的黑白圖像：被砍下的頭顱、被開膛的腹腔以及裸體的婦女，強奸她們的士兵迫使她們做出各種色情的姿勢，她們的臉上則露出了令人難忘的痛苦和羞辱的表情”。這些照片，成為張純如寫作《南京暴行：被遺忘的大屠殺》的直接動因。

5.6 細菌裂解釋放內毒素

在噬菌體治療過程中，不僅體內宿主菌被噬菌體裂解后會釋放大量內毒素，而且在噬菌體制劑的制備提純過程中也很難避免細菌內毒素的混入，使噬菌體制劑在體內的使用遭遇困難。

6 噬菌體治療的展望

6.1 篩選較寬噬菌譜的噬菌體

噬菌體具有嚴格的宿主專一性，這使其在細菌分型、檢測及特異性殺傷方面具有優勢；而過于嚴格的專一性使得噬菌體僅能對特定型別的宿主菌產生作用，給臨床治療帶來困難，因此，需要篩選能夠殺傷多種細菌亞型的噬菌體，或通過基因改造獲得具有較寬噬菌譜的噬菌體。早期研究中，Merril等人通過向小鼠腹腔內連續注射噬菌體，篩選到能夠逃避網狀內皮系統誘捕從而在體內長期存活的突變株，即“長期循環”表型噬菌體，從而獲得與親本噬菌體相較更理想的治療效果［17］。而在現代研究中，利用基因技術解析已知寬噬噬菌體的基因序列，對其他噬菌體進行基因改造以使其獲得較寬噬菌譜，將使噬菌體更適合于臨床應用。

6.2 優化給藥途徑

局部病灶直接給藥能避免循環系統對噬菌體的免疫作用，從而降低噬菌體被清除的可能性。對于噬菌體難以直接接觸的胞內寄生菌，如結核分枝桿菌和鳥分支桿菌，利用恥垢分枝桿菌作為載體向吞噬細胞內傳遞噬菌體，從而殺滅胞內的鳥分枝桿菌和結核分枝桿菌［17－19］。另外，也有研究利用脂質體作為載體將噬菌體送入胞內從而達到治療效果［20］。

6.3 篩選強裂解性噬菌體

噬菌體的裂解性越強，治療宿主菌的感染越有效。通過噬菌斑的大小反復多次篩選，可以獲得針對同種宿主菌的強烈解性噬菌體。

6.4 避免噬菌體所攜帶的毒力因子

一些噬菌體攜帶有毒素基因，其編碼的一些調控因子或酶參與細菌毒性的表達。

6.5 減少裂解導致的內毒素釋放量

噬菌體介導的裂解使細菌內毒素大量釋放，由此可能引起經過基因修飾的非裂解性噬菌體，如溶菌酶缺陷型噬菌體可以殺死宿主細菌而不使其發生裂解，從而避免內毒素的釋放。通過基因修飾改造線狀噬菌體，能夠產生對細菌致命的蛋白質，但不使細菌裂解，在達到殺菌目的的同時減少內毒素釋放［21］。

6.6 建立針對臨床病原菌分離株的噬菌體庫

由于噬菌體對宿主具有嚴格的選擇性，因此對于任意特定種類的細菌，都需要應對以相應的高敏感性噬菌體，這就需要收集和篩選大量的專一性噬菌體保存，以建立較為完備的噬菌體庫。

7 結束語

綜上所述，近年來不斷開展的噬菌體抗感染治療實驗表明，噬菌體作為新型抗感染藥物，具有廣闊的發展前景。特別在面對多重耐藥細菌感染的治療上，噬菌體制劑具有明顯的優越性。但目前需要進一步研究噬菌體在體內的藥物動力學問題，迫切需要解決問題有噬菌體的寬噬性和噬菌體制劑安全性等。希望通過不斷地探索實驗，使噬菌體的抗感染治療方法得到不斷的完善，同時也使人們在抗感染研究方面取得突破性的進展。

1 Waldor MK，Friedman DI，Adhya SL.Phages their role in bacterial pathologenesis and biotechnology［M］.Washington，DC：ASM Press，2005，423－424.

2 Summers WC.On the origins of the science in Arrowsmith：Paul de Kruif，Felix d′Herelle，and phage［J］.J Hist Med Allied Sci，1991，46（3）：315－332.

3 Summers WC.Bacteriophage therapy［J］.Ann Rev Microbiol，2001，55（10）：437－451.

4 司穉東，何曉青.噬菌體學 ［M］.北京：科學出版社，1996，179－180.

5 O′Flaherty S，Ross RP，Coffey A.Bacteriophage and their lysins for elimination of infectious bacteria［J］.FEMS Microbiol Rev，2009，33（4）：801.

6 Debarbieux L，Leduc D，Maura D，et al.Bacteriophages can treat and prevent Pseudomonas aeruginosa lung infections［J］.J Infect Dis，2010，201（7）：1096－1104.

7 Matsuzaki S，Yasuda M，Nishikawa H，et al.Experimental protection of mice against lethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage phi MR11［J］.J Infect Dis，2003，187（4）：613－624.

8 Morello E，Saussereau E，Maura D，et al.Pulmonary bacteriophage therapy on Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis strains：first steps towards treatment and prevention［J］.PLoS One，2011，6（2）：e16963.

9 徐焰.噬菌體溶菌機制研究進展［J］.重慶醫學，2003，32（1）：106－108.

10 文細毛，任南，吳安華，等.全國醫院感染監控網醫院感染病原菌分布及變化趨勢［J］.中國感染學雜志，2011，21（2）：350－355.

11 呂欣.噬菌體在細菌性感染治療中的應用及展望［J］.國外醫學病毒學分冊，2002，8（6）：190－192.

12 Carlton RM.Phage therapy：past history and future prospect［J］.Arch Immunol Ther Exp，1999，47（5）：267－274.

13 Biswas B，Adhya S，Washart P，et al.Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate of vancomycin－resistant Enterococcus faecium［J］.Infect Immun，2002，70（1）：204－210.

14 Bruttin A，Brussow H.Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4orally：A safety test of phage therapy［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（7）：2874－2878.

15 馬曉麗，吳慶慶，溫龍平.噬菌體在血液中的失活及其機理的初步研究［J］.中國科學技術大學學報，2009，39（1）：90－93.

16 Weld RJ，Butts C，Heinemann JA.Models of phage growth and their applicability to phage therapy［J］.J Theor Biol，2004，227（1）：1－11.

17 Merril CR，Biswas B，Carlton R，et al.Long－circulating bacteriophage as antibacterial agents［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（8）：3188－3192.

18 Broxmeyer L，Sosnowska D，Miltner E，et al.Killing of Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis by a mycobacteriophage delivered by a nonvirulent mycobacterium：a model for phage therapy of intracellular bacterial pathogens［J］.J Infect Dis，2002，186（8）：1155－1160.

19 Danelishvili L，Young LS，Bermudez LE.In vivo efficacy of phage therapy for Mycobacterium avium infection as delivered by a nonvirulent mycobacterium［J］.Microb Drug Resist，2006，12（1）：1－6.

20 黃新，高飛絮，常勝合，等.噬菌體脂質體包被液治療小鼠耐多藥結核的初步研究［J］.中國新藥雜志，2008，17（6）：482－485.

21 Hagens S，Habel A，von Ahsen U，et al.Therapy of experimental Pseudomonas infection with a non－replicating genetically modified phage［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（10）：3817－3822.