液基細胞學在對NSCLC胸腔積液癌細胞ERCC1等基因檢測中的應用

陶 玉 吉志固 劉玉山 陸曉云 周建云 陳亞麗 何 松

在肺癌的臨床診治工作中，我們常常遇到許多患者就診時的首發癥狀為胸腔積液或心包積液，這時的臨床分期已屬ⅢB或Ⅳ期，即肺癌晚期。對其胸腔積液或心包積液查找惡性腫瘤細胞并分型診斷，可能成為這部分患者獲得病理學依據的唯一方法。目前對非小細胞肺癌(non-small cell lung cance，NSCLC)的標準化療，主張以ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等基因檢測結果為指導的個體化治療。我們采用液基細胞學檢測技術(liquid based cytology test，LCT)，對71例胸腔積液或心包積液標本在作出細胞學診斷的同時進行了ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等基因檢測，旨在為晚期NSCLC的個體化治療提供實驗依據。現將我們的實驗結果總結如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集我院2009年2月～2011年12月的胸腔積液或心包積液標本，共獲得晚期NSCLC 71例，所有標本必須滿足以下條件:①液基細胞薄片經HE染色后由2位資深細胞學醫師共同閱片并一致診斷為NSCLC;②HE染色的液基細胞片內可見較多癌細胞;③有足夠的剩余標本可供免疫細胞化學檢查。71例晚期NSCLC中腺癌69例，鱗癌1例，腺鱗癌1例。男性患者40例，女性31例;年齡39～86歲，平均年齡62.3歲。

1.2 設備及試劑

1.2.1 液基細胞薄片制作儀器與試劑 程控離心機 Hettich 46，超柏 Auto Cyte PREP液基細胞薄片自動制片機(美國Tripath ImaginInc)及隨機配置的一次性耗材:12 m l離心管、移液Tip頭、細胞沉降管、玻片、紅色固定液。自配耗材:50 ml離心管、Tris緩沖粉、蘇木精、伊紅、無水乙醇。

1.2.2 免疫細胞化學染色儀器和試劑 免疫組化全自動染色機(美國 LAB VISION，AUTO STAINER 720)，單克隆一抗 ERCC1(NeoMarker公司，1∶350)、RRM1(ProteintechGroup，1∶500)、β-tubulinⅢ(BioGenex公司，1∶1000);ERCC1免疫染色所用二抗為PV-9000 Anti-Mouse/Rabbit(北京中杉生物技術有限公司)，RRM1及β-tubulinⅢ免疫染色所用二抗為EnVision Anti-Mouse/Rabbit(Dako公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腔積液/心包積液液基細胞薄片的制作［1］①將臨床新鮮送檢的漿膜腔積液靜置15 min左右后取底層的液體(＞50 ml時)45 m l入50 ml離心管(為確保可制成多張含足量癌細胞的優質液基細胞薄片，建議臨床多抽取或將引流的胸腔積液全部送檢)。②用程控離心機程序3離心10 min(離心力為600 g)，對于含瘤細胞少的標本需多次取樣離心收集細胞，直至灰白細胞團達20 ul以上方可(含瘤細胞過少且無法獲取足夠標本量者不宜做此實驗)，去上清液后加入10 ml紅色固定液(血性標本用吸管吸取瘤細胞層入紅色固定液以去除過多的紅細胞)。③將50 ml離心管再置離心機內用程序3離心10 min，去上清液后加入 pH 8.0的10 m l Tris緩沖液，振蕩，經紗布過濾后將標本轉移至12 ml離心管內。④用離心機程序4離心5 min，去除上清液后振蕩，將聚集在管底細胞團振散、混勻，并視細胞團的大小加入適量的Tris緩沖液。⑤將盛有細胞的混懸液的12 ml離心管置于超柏TM Auto Cyte PREP液基細胞薄片自動制片機上，啟動PrepStain系統 ，輸入"NONGYN"進入非婦科制片系統，按照系統的操作提示輸入參數進行液基細胞薄片程序化常規制片染色，先制作1張HE片，將余下的液基細胞混懸液置冷藏室。⑥將經HE診斷為NSCLC且含一定量瘤細胞的液基細胞混懸液重新放到制片機上，仍進入非婦科制片系統，按照制片要求輸入參數，終止于常規HE染色前(為保證每例每張供免疫細胞化學的液基細胞片含有一定量瘤細胞且厚薄均勻適當，應根據HE片含瘤細胞的情況，調節好細胞混懸液的濃度，含瘤細胞較少的在制片過程中輔以手工將收集的所有細胞全部均勻地倒入各細胞沉降管內)，將制作好的液基細胞薄片收集待免疫細胞化學。

1.3.2 免疫細胞化學染色 液基細胞片入PBS緩沖液30 min后直接入免疫組化全自動染色機進行免疫細胞化學染色。ERCC1采用PV-9000法(一抗孵育60 min，PV-9000-1、PV9000-2分別孵育20 min，DAB顯色6 min)。RRM1、β-tubulinⅢ 采用 En-Vision法(一抗孵育60 min，EnVsion Anti-Mouse/Rabbit二抗孵育30 min，DAB顯色)。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ陽性組織作為陽性對照。免疫細胞化學染色結束后，蘇木精復染、中性樹膠封固。

1.3.3 免疫細胞化學結果判斷 ERCC1陽性定位于細胞核，RRM1及β-tubulinⅢ定位于細胞質。參照復旦大學附屬腫瘤醫院提出的結果判斷標準［2］，首先將染色強度計分:0分為無色;1分為淡黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。再按陽性細胞數占腫瘤細胞的百分比計分:無陽性細胞為0分;陽性細胞數占比≤10%為1分;11% ～50%為2分;51% ～75%為3分;＞75%為4分。將染色強度得分與陽性細胞百分比得分的乘積作為判斷依據:0～3分為"-"，4～6分為"+"，7～9分為"++"，10～12分為"+++"。

2 結果

2.1 鏡檢

涂膜面積直徑僅為1.3 cm的LCT細胞薄片，細胞分布均勻、紅細胞大多破壞消失 ，涂片背景清晰、異常細胞清楚可見。細胞因采用濕固定且及時，細胞形態保存完好;免疫細胞化學染色的陽性定位準確可靠;背景干凈，非特異性背景染色無或較輕，易于判讀診斷。

2.2 免疫細胞化學表達結果

71例NSCLC胸腔積液癌細胞ERCC1、RRM1和 β-tubulinⅢ蛋白表達結果分別為:ERCC1陰性36例(50.7%)，陽性35例(49.3%);RRM1 陰性 52 例(73.2%)，陽性 19 例(26.8%);β-tubulin Ⅲ陰性 22 例(31.0%)，陽性49 例(69.0%)，見表1。

表1 71例NSCLC胸腔積液癌細胞ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ蛋白表達結果(例，%)

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中NCSLC約占所有肺癌的80%，且多數患者確診時已處于晚期，臨床已失去手術治療的機會，化療是晚期NSCLC的主要治療手段。然而NSCLC遠不如小細胞肺癌對化療敏感，化療有效率低，患者長期生存率低。上世紀90年代以來，隨著第3代化療藥物吉西他濱(gemcitabine，Gem)、去甲長春花堿(vinorelbine，NVB)、紫杉醇(paclitaxe，l TXL)和多西紫杉醇(docetaxe，l TXT)等的出現和應用，以鉑類為基礎新的聯合化療方案成為NSCLC的標準化療方案，但是聯合化療有效率也只有30% ～40%，5年生存率僅改善5%左右［3］。同一種病理類型和分期的NSCLC用相同的方案及劑量化療，在不同個體上療效存在明顯差異，使得化療只對部分NSCLC患者有效，而大部分患者除了遭受化療的毒副作用外并未獲益［4］，此現象考慮與腫瘤耐藥有關。

近年來國內外的大量研究顯示［5～8］，ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ基因表達水平，分別與順鉑、吉西他濱、紫杉醇類/長春堿類耐藥相關。聯合檢測這些標記可以初步預測該患者對某種藥物的敏感程度及其預后，進而針對不同個體設計不同的化療方案，以提高化療療效、減少不敏感藥物給患者帶來的不良反應，節約醫療資源。

然而，在國內外研究中所用實驗材料基本上源自手術切除或活檢的組織學標本，對于僅表現為癌性胸腔積液的晚期NSCLC已無法通過手術獲取標本，因此如何使這部分患者獲得滿意的樣本材料，并進行上述耐藥基因檢測是實際工作中迫切需要解決的問題。通過胸腔穿刺/心包穿刺直接抽取積液標本獲取瘤細胞容易、快捷、經濟，對患者創傷小，可重復性強，但傳統的方法手工涂片制出的細胞片，厚薄不勻、背景不清、尤其是血性胸腔積液/心包積液瘤細胞收集較難，背景過深，難以做出理想的免疫細胞化學片，標記結果判讀困難。我們將收集的71例惡性胸腔積液/心包積液用LCT技術進行細胞制片，杜絕了傳統手工細胞涂片的諸多不足。制出的液基細胞薄片，面積小(直徑僅為1.3 cm)，背景清晰、紅細胞大多被去除、癌細胞數量多、分布均勻，標本因及時采用濕固定法，細胞形態及抗原分子保存良好。經免疫細胞化學標記的細胞片陽性定位準確，背景干凈，非特異性背景染色無或較輕，易于判讀，其結果與組織學切片的免疫組織化學結果基本一致。因此我們認為對表現為胸腔積液或心包積液的晚期NSCLC患者可抽取積液，經常規細胞學檢查明確診斷后，采用液基細胞學制片技術檢測以獲得合格的ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等免疫細胞化學檢測需要的標本，從而實現對化療藥物敏感性的預測，為患者實施個體化治療。

［1］ 陶 玉，何 松，吉志固.液基細胞學技術在非婦科標本中的應用體會〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2009，25(5):559.

［2］ 許良忠，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準〔J〕.中國癌癥雜志，1996，6(4):229.

［3］ Arriagada R，Bergman B，Dunant A，et al.Cisplatin based adjuvant chemotherapy in patients with completely resected non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl JMed，2004，350(4):351.

［4］ Rosell R，Cecere F，Santarpia M，etal.Predicting the outcome of chemotherapy for lung cancer〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2006，6(4):323.

［5］ Olaussen KA，Ariane D，Fouret P，etal.DNA repair by ERCC1 in nonsmall-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy〔J〕.N Engl JMed，2006，355(10):983.

［6］ Bepler G，Kusmartseva I，Sharma S，etal.RRM1modulated in vitro and in vivo efficacy of gemcitabine and platinum in non-small cell lung cancer〔J〕.JClin Oncol，2006，24(29):4731.

［7］ 江 波，趙金奇.RRM1與非小細胞肺癌吉西他濱化療耐藥相關性的研究進展〔J〕.實用癌癥雜志，2010，25(5):544.

［8］ Gan PP，Pasquier E ，KavallarisM.ClassⅢ beta-tubulinmediates sensitivity to chemotherapeutic drugs in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res ，2007，67(19):9356.