HRM方法檢測非小細胞肺癌患者胸水標本癌細胞基因突變的臨床意義

李 梅，呂偉朋，韋 鴻，姜振富，呂海辰，呂 申

(1.大連醫科大學附屬第二醫院實驗中心，遼寧大連116027;2.大連醫科大學附屬第二醫院神經外科，遼寧大連116027; 3.復旦大學上海醫學院臨床醫學(8年制)2007級，上海200032)

HRM方法檢測非小細胞肺癌患者胸水標本癌細胞基因突變的臨床意義

李 梅1，呂偉朋1，韋 鴻1，姜振富2，呂海辰3，呂 申1

(1.大連醫科大學附屬第二醫院實驗中心，遼寧大連116027;2.大連醫科大學附屬第二醫院神經外科，遼寧大連116027; 3.復旦大學上海醫學院臨床醫學(8年制)2007級，上海200032)

［目的］探討應用HRM方法檢測非小細胞肺癌患者胸水標本癌細胞EGFR、KRAS基因突變用于指導EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑治療的可行性。［方法］收集36例非小細胞肺癌患者胸水標本，常規提取DNA，HRM方法檢測KRAS基因第2外顯子、EGFR基因第19和21外顯子突變。統計分析胸水標本與前期檢測過的非小細胞肺癌組織KRAS、EGFR突變率差異。［結果］胸水標本36例中，2例(5.6%)KRAS突變，10例(27.8%)EGFR突變(其中EGFR第19和21外顯子突變各5例)。前期檢測過的非小細胞肺癌組織KRAS和EGFR突變率分別為5.8%和36.3%。KRAS和EGFR突變率在胸水標本與前期非小細胞肺癌組織中差異均無顯著性意義(P＞0.05)。［結論］對難以獲得肺癌組織標本的非小細胞肺癌患者可應用HRM方法檢測胸水標本篩查KRAS、EGFR基因突變，指導EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑應用。

HRM;胸水標本;非小細胞肺癌

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，手術治療和化療是對其治療的主要手段。然而一些晚期NSCLC患者，因失去了手術機會，只能通過化療控制腫瘤的生長，延長生命。近年來分子靶向藥表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI)，如Gefitinib等在臨床逐漸推廣使用。該類藥物以其療效好、毒副作用小的特點給NSCLC患者帶來了希望。該藥物的針對性很強，患者間療效差異很大，且藥價昂貴。因此，在用藥前有效判斷NSCLC患者對該藥的敏感性非常必要。目前認為EGFR第19或21外顯子突變是NSCLC對EGFRTKI藥物敏感的標志，而KRAS第2外顯子突變則是耐藥的標志。所以NSCLC患者在接受EGFRTKI類藥物治療前，通常需要檢測腫瘤細胞的這3段基因突變情況，以確定是否用藥。對于手術NSCLC患者，通常可以利用手術切除的癌組織標本檢測這3段基因的突變情況，但一些失去手術機會的患者常因為無法獲取腫瘤組織而失去對藥物敏感性檢測的機會。如果能夠從較容易獲得的胸水標本中檢測上述3段基因突變情況，以此獲得患者對藥物敏感狀況的信息將具有重要臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 標本收集

收集2009年—2010年大連醫科大學附屬第二醫院經細胞學或病理學檢查確診為非小細胞肺癌的患者胸水36份。NSCLC患者中，男19例，女17例，年齡(63.8±13.9)歲。

1.2 DNA提取和HRM法基因突變檢測

常規DNA提取試劑盒法(天根生物技術有限公司北京)提取胸水標本DNA，常規PCR擴增EGFR第19、21外顯子和KRAS第2外顯子，引物，反應條件、反應體系同前［1-2］。應用 High resolution melting(HRM)方法進行基因突變檢測，應用Lightscanner(Idaho Technology USA)在溫度72～90℃收集熒光信號［1-2］。

1.3 統計學方法

數據分析應用SPSS 15.0統計軟件進行，應用χ2檢驗比較胸水標本與前期新鮮肺癌組織標本KRAS第2外顯子及EGFR第19、21外顯子突變率差異，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 KRAS突變檢測

HRM法檢測KRAS基因突變結果顯示(圖1):胸水標本36例中KRAS第2外顯子突變共2例(5.6%)，均為腺癌，患者男性1例、女性1例。

前期應用HRM方法檢測103例NSCLC患者手術切除肺癌組織KRAS突變，發現突變的共6例(5.8%)［1］。應用HRM方法檢測肺癌組織標本和胸水標本中KRAS突變，兩種標本中KRAS突變率差異無顯著性意義(P＞0.05)。

圖1 HRM法檢測KRAS第2外顯子突變結果Fig 1 Detecting KRAS mutation in exon 2 with HRM

2.2 EGFR突變檢測

HRM法檢測EGFR基因突變結果顯示(圖2、3):胸水標本36例中EGFR第19、21外顯子突變共10例(27.8%)，其中19外顯子突變5例，均為腺癌，患者女性2例、男性3例;21外顯子突變5例，均為腺癌，患者女性3例、男性2例。

前期應用HRM方法檢測157例NSCLC患者手術切除肺癌組織EGFR突變，發現19、21外顯子突變共57例(36.3%)［2］。應用HRM方法檢測肺癌組織標本和胸水標本中EGFR突變，兩種標本中EGFR突變率差異無顯著性意義(P＞0.05)。

圖2 HRM法檢測EGFR第19外顯子突變結果Fig 2 Detecting EGFR mutation in exon 19 with HRM

圖3 HRM法檢測EGFR第21外顯子突變結果Fig 3 Detecting EGFR mutation in exon 21 with HRM

3 討論

分子靶向藥物 EGFR-TKI的出現及其在NSCLC治療中的應用為NSCLC患者治療帶來希望。該藥針對性強、療效好、毒副作用小，但價格昂貴，如果不敏感患者盲目用藥，不但貽誤治療時機，同時也帶來家庭經濟負擔。因此，用藥前的敏感性檢測是有的放矢用藥得以實施的關鍵。2004年New England Journal Medicine和Science先后報道了有EGFR第19和21外顯子突變腫瘤的患者常對Gefitinib等EGFR-TKI藥物敏感，相反有KRAS第2外顯子突變腫瘤的患者多表現為對該類藥物的耐藥，隨后大量研究也證實EGFR和KRAS突變可以作為反映EGFR-TKI藥物敏感性的分子標志［3-7］。對于手術治療的NSCLC患者可以應用手術切除的癌組織(無論新鮮癌組織還是石蠟包埋的癌組織)進行基因檢測，對于失去手術機會的晚期NSCLC患者可以通過穿刺獲得癌組織標本用于基因檢測，但穿刺風險大，臨床實施困難。胸水常出現在晚期NSCLC患者，但胸水中癌細胞數量不定，有時癌細胞數量極少，甚至找不到癌細胞，如果基因檢測方法靈敏度不高就會出現假陰性的結果。因此，靈敏的基因檢測方法是能否利用胸水檢測EGFR和KRAS基因突變，并判斷患者對EGFR-TKI藥物敏感性的關鍵。HRM方法是近年來出現的準確、敏感、快速基因突變檢測方法，而且檢測過程均為閉管操作，能有效地避免污染機會，是可用于臨床的、便捷基因突變檢測方法。本研究組在國內率先從美國引進了該技術，應用該技術從突變細胞比例低至2.5%的混合樣品中檢測出了變異基因［1］。通過比較胸水標本與肺癌組織標本的該方法EGFR、KRAS基因突變檢出率，作者發現兩種樣本的EGFR、KRAS基因突變檢出率幾乎相同，沒有統計學上的顯著差異。這提示HRM方法可用于檢測胸水標本的EGFR、KRAS基因突變。本研究結果EGFR突變患者中男性患者比例較大，而KRAS突變患者中女性患者比例較大，這與作者的前期研究結果以及其他研究機構的研究結果不一致，可能是由于樣本例數少所致，今后還將增加病例數進一步研究。

總之，檢測胸水EGFR和KRAS基因突變HRM方法的建立對指導晚期NSCLC患者EGFR-TKI藥物的應用有重要意義。

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Feasibility of HRM to detect gene mutations in hydrothorax of patients with non-small cell lung cancer

LI Mei1，Lü Wei-peng1，WEI Hong1，JIANG Zhen-fu2，Lü Hai-chen3，Lü Shen1
(1.Laboratory Center，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China;2.Neurosurgery Department，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China;3.2007 8-year-MD Candidate，Shanghai Medical University Fudan University，Shanghai 200032，China)

［Objective］To explore the clinical significance of HRM to detect EGFR and KRAS gene mutations in hydrothorax of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)for directing EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy.［Methods］The mutations of KRAS gene in exon 2 and EGFR gene in exon 19，21 were detected with HRM.The frequencies of EGFR and KRAS mutations between hydrothorax samples and cancer tissue samples from patients with NSCLC were analyzed statistically.［Results］There were 2 cases(5.6%)with KRAS mutations and 10 cases(27.8%)with EGFR mutations，including 4 cases in exon 19 and 5 cases in exon 21 found in hydrothorax with HRM.The frequencies of KRAS and EGFR mutation，detected in NSCLC tissues before，were 5.8%and 36.3%separately.There was no significant differencein either KRAS or EGFR between hydrothorax and cancer tissue samples.［Conclusion］It is helpful to patients with NSCLC who have lost the operation opportunity to detect the gene mutation in hydrothorax with HRM in directing the EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy.

HRM;hydrothorax samples;non-small cell lung cancer

R730

A

1671-7295(2012)04-0321-03

國家自然科學基金項目(81071805)

2012-04-05;2012-06-20

李梅(1977-)，女，遼寧撫順人，主治醫師。

呂申，教授，博士生導師。E-mail:lvshen1956@yahoo.com.cn