凍蝦仁中一株發酵阿拉伯糖的溶藻弧菌的分離鑒定

摘要：在對一份凍蝦仁樣品的檢測過程中分離到一株弧菌，經過形態觀察、自動生化測試和手工生化測試，最終鑒定為發酵阿拉伯糖的特殊生化型溶藻弧菌。敘述了檢測、分離和鑒定的過程，并對弧菌鑒定的方法選擇和弧菌病的防治作了探討。

關鍵詞：凍蝦仁；溶藻弧菌；阿拉伯糖；分離鑒定

中圖分類號：Ｑ９３９．１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3479-04

Isolation and Identification of a Vibrio alginolyticus Strain Fermenting Arabinose from Frozen Shrimp

ＣＨＥＮ Ｗｅｉ－fｅｎｇ１，ＺＨＵ Ｌｕ２，ＨＯＮＧ Ｓｈｕ－yｉｎ１，ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－lｉｎｇ１

（１． Ｆｅｎｇｈｕａ Eｎｔｒｙ－ｅｘｉｔ Iｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Qｕａｒａｎｔｉｎｅ Bｕｒｅａｕ，Ｆｅｎｇｈｕａ ３１５５００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０２０， Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ Ｖｉｂｒｉｏ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｒｉｍｐ ａｎｄ ｕｌｔｉｍａｔｅｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｒａｒｅ Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｒｉｍｐ； Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ； ａｒａｂｉｎｏｓｅ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）是１２種人類致病性弧菌之一，專性嗜鹽，廣泛分布于海洋和江河入海口的水域中，數量居海水類弧菌之首。該菌最初被劃分為副溶血性弧菌的生物Ⅱ型，后來根據基因組同源性分析結果將其劃為一個獨立的種［１］。溶藻弧菌是水產養殖，特別是海水養殖中重大流行病的引發源之一，可引起魚類潰瘍病、蝦類紅腿病、白斑病等［２］。該菌也是人類的條件致病菌，可引起人類食物中毒［３］、傷口感染［４］、筋膜炎［５］等疾病。林業杰等［６］的研究發現有5.0％的溶藻弧菌檢出ＳＴ腸毒素、２０.0％的溶藻弧菌檢出ＬＴ腸毒素、８８．１％的溶藻弧菌菌株能產生溶血素，因而認為該種細菌可能含有多種致病因子，應當與副溶血性弧菌同等重視。

通過菌落形態觀察、嗜鹽性試驗、糖發酵試驗和其他生化試驗，可以將溶藻弧菌和副溶血性弧菌、霍亂弧菌等常見致病性弧菌區分開來。對一份凍蝦仁樣品檢測過程中分離到的一株弧菌經過形態觀察、自動生化測試和手工生化測試，最終鑒定為發酵阿拉伯糖的溶藻弧菌菌株，是一種罕見的生化型，同時對弧菌鑒定的方法選擇和弧菌病的防治作了探討。

１ 材料與方法

１．１ 材料

出口企業送檢的凍蝦仁樣品。

１．２ 主要試劑

緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（ＴＴＢ）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（ＳＣ）、亞硫酸鉍瓊脂（ＢＳ）、Ｈｅｋｔｏｅｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ瓊脂（ＨＥ）、硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖瓊脂（ＴＣＢＳ）、微量生化管均為北京陸橋技術有限責任公司產品；ＧＮＩ＋革蘭氏陰性菌測試卡及配套試劑、ＡＰＩ ２０Ｅ（腸桿菌等革蘭氏陰性菌測試條）均為法國生物梅里埃公司產品；弧菌顯色培養基（法國科瑪嘉）。

１．３ 試驗方法

１．３．１ 增菌培養和菌株分離 按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（ＧＢ ４７８９．４－２０１０）［７］對樣品進行檢測。取２５ ｇ樣品加入到２２５ ｍＬ緩沖蛋白胨水中，充分均質后３６．０ ℃培養１８ ｈ。分別取１ ｍＬ培養液轉接至１０ ｍＬ ＴＴＢ和１０ ｍＬ ＳＣ中，增菌培養２４ ｈ后劃線接種至ＢＳ和ＨＥ平板。

１．３．２ 挑取可疑菌落與自動生化鑒定 挑取可疑菌落，接種于三糖鐵斜面上，并用營養瓊脂平板純化，菌株編號為５４１２－１。純化菌株進行革蘭氏染色鏡檢，按ＧＢ ４７８９．４－２０１０進行賴氨酸脫羧酶、靛基質、尿素酶和氰化鉀試驗。測定氧化酶活性，按ＧＮＩ＋革蘭氏陰性菌測試卡使用說明進行自動生化測試，測試設備為ＶＩＴＥＫ ３２微生物分析系統。

１．３．３ 弧菌選擇性培養基觀察與微量生化測試 根據自動生化測試結果，初步判斷５４１２－１菌株為弧菌屬細菌。將該菌株接種到ＴＣＢＳ和弧菌顯色培養基中，觀察菌落形態。參照ＧＢ／Ｔ ４７８９．７－２００８《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》［８］和《伯杰氏系統細菌學手冊》［１］關于弧菌屬內常見菌株的生化特征的描述，對５４１２－１菌株的耐鹽生長能力和主要生化指標進行了進一步研究。

１．３．４ ＡＰＩ ２０Ｅ確認試驗 新鮮培養的菌落加入到５ ｍＬ ０．８５％ＮａＣｌ培養液中制成１．０麥氏濃度的菌懸液。按要求將菌懸液加入到ＡＰＩ ２０Ｅ試劑條的測試孔中，培養過夜觀察結果。

２ 結果與分析

２．１ 平板分離與初步鑒定結果

在對一份凍蝦仁樣品進行沙門氏菌項目的檢測過程中，在ＨＥ平板上發現藍綠色圓形的菌落（圖１a），挑取典型菌落純化，編號為５４１２－１。該菌株經染色觀察，為革蘭氏陰性桿菌。按照ＧＢ ４７８９．４－２０１０測定其生化特征，結果為不產Ｈ２Ｓ，尿素酶、賴氨酸脫羧酶、靛基質和氰化鉀試驗均為陰性。使用ＧＮＩ＋革蘭氏陰性菌鑒定卡進行自動生化測試（用０．４５％ ＮａＣｌ溶液作稀釋液），結論為５０％溶藻弧菌／４９％副溶血性弧菌。以上結果排除了５４１２－１是沙門氏菌的可能，并提示該菌株很可能是弧菌。因此使用０．８５％ ＮａＣｌ溶液作稀釋液再次進行自動生化測試，結果見表1。測試結論為６６％副溶血性弧菌／１７％溶藻弧菌，尚無法得到可接受的鑒定結果，需用其他方法進一步鑒定。

２．２ 弧菌選擇性平板觀察與微量生化測試結果

菌株５４１２－１在ＴＣＢＳ和弧菌顯色培養基上的生長情況見圖１ｂ和圖１ｃ。在ＴＣＢＳ培養基上呈黃色圓形菌落，直徑約１～２ ｍｍ。在弧菌顯色培養基上呈白色圓形菌落。參照ＧＢ／Ｔ ４７８９．７－２００８和《伯杰氏系統細菌學手冊》，使用常規手工方法測試５４１２－１菌株的生化特征，結果見表２。結合菌株５４１２－１的菌落形態和生化特征，該菌株與典型溶藻弧菌最接近，但對阿拉伯糖的發酵能力有差異；與副溶血性弧菌在１０％ＮａＣｌ生長試驗、蔗糖發酵和ＶＰ試驗中存在差異。

２．３ ＡＰＩ ２０Ｅ試驗確認結果

為準確鑒定５４１２－１菌株，使用ＡＰＩ ２０Ｅ測試條對以上結果進行確認，結果（表３）表明，５４１２－１與溶藻弧菌之間阿拉伯糖發酵試驗不符，ＶＰ和苦杏仁苷發酵試驗符合度較低。鑒定數值為４１４７１２７，查詢ＡＰＩ ２０Ｅ數據庫，結論為８７．４％溶藻弧菌，為可接受的鑒定結果。綜合以上形態和生化測試結果，可將５４１２－１菌株鑒定為一株罕見的發酵阿拉伯糖的溶藻弧菌。

３ 小結與討論

在一份凍蝦仁樣品中分離到一株溶藻弧菌，ＧＮＩ＋自動生化測試、常規手工生化測試和ＡＰＩ ２０Ｅ測試結果均顯示該細菌能夠發酵阿拉伯糖。根據文獻統計，這種生化型只占１％，比較罕見［１］。而且這一特殊菌株是在用于沙門氏菌等腸桿菌科細菌分離的ＨＥ平板上得到，更是未見類似報道。ＶＩＴＥＫ 32自動生化鑒定系統是一種快速準確的微生物鑒定設備，目前已廣泛應用于醫療和工業領域。但該系統在弧菌鑒定領域是相對的弱項［９］，在鑒定５４１２－１這一特殊生化型菌株時經過反復測試均未能得到滿意結果，只提示該菌株可能是弧菌。常規手工生化測試和ＡＰＩ ２０Ｅ則取得了可以接受的鑒定結果。所以在弧菌檢測中應避免絕對化，不應過于依賴儀器，對于儀器給出的鑒定報告應當詳細審查，為污染控制、疾病防治提供可靠依據。

溶藻弧菌在水環境和水產品中的含量較高，給水產養殖和人類健康帶來重大威脅。由于人們對溶藻弧菌的認識起步較晚，對其防治措施的研究較霍亂弧菌和副溶血性弧菌差距較大。在養殖環節主要通過使用抗生素來控制溶藻弧菌病害，但這種方法易引起病菌抗藥性增強，污染水體和環境，并間接危害人體健康。近年來，陸續研發出一些新的防治方法，主要有益生菌法，如利用乳酸菌［１０］和枯草芽孢桿菌［１１，１２］改善水產品和養殖環境的微生態；免疫增強劑法，如使用海藻酸鈉［１３］、幾丁質和殼聚糖［１４］、中草藥［１５］等增強水產動物的先天免疫體系；接種溶藻弧菌疫苗，包括菌體疫苗［１６］、亞細胞結構疫苗［１７］和ＤＮＡ疫苗［１８］。但這些新方法大多仍處于試驗階段，商品化、低成本、易操作的產品很少。水產品生產加工中的衛生處理也是減少溶藻弧菌污染的重要環節。常見有紫外殺菌法和殺菌劑法（二氧化氯、次氯酸鈉和臭氧水等）［１９］，應綜合殺菌效果和產品銷售地區的消毒劑限量要求選擇衛生處理方法。人體溶藻弧菌病的預防主要是要形成科學的飲食和生活習慣，生食水產品、腌制海產品和水上運動時不注意清潔衛生［２０］等行為均可能引發感染。因溶藻弧菌引起的食物中毒或感染可有選擇地采用抗生素治療［２１］。隨著人們對溶藻弧菌危害的認識逐步加強，對其污染的預防和控制也越來越受重視。目前最需要做的是制定溶藻弧菌檢測標準和限量規范，開發適用于水產養殖、加工的防治方法，以及總結人類感染溶藻弧菌的案例和治療方案。

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