低溫脅迫對觀光木幼苗離體葉片生理特性的影響

摘要：以一年生盆栽觀光木幼苗為材料，研究了低溫脅迫（１２、８、４、０ ℃）下幼苗葉片有關的生理生化指標變化及其與抗寒性的關系。結果表明，低溫對觀光木葉片的相對電導率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、脯氨酸和可溶性糖含量的影響均達到極顯著水平。隨溫度的降低，觀光木葉片的相對電導率、脯氨酸和可溶性糖含量不斷升高；丙二醛含量呈先上升后略下降的變化趨勢，但總體高于對照（２５ ℃）的含量；超氧化物歧化酶活性也不斷升高，且在０ ℃時達到最大值，為對照的４．４３倍。相關性分析結果顯示，低溫與相對電導率、可溶性糖含量的相關系數均達０．８９４以上，呈顯著的負相關，但低溫與丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量的相關性不顯著。

關鍵詞：觀光木；葉片；低溫脅迫；生理特性

中圖分類號：Ｑ９４９．７４７．１；Ｑ９４８．１１２＋．２；Ｑ９４６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3524-04

Effects of Low-Temperature Stress on Physiological Characteristics of In Vitro Tsoongiodendron odorum Seedlings Leaves

ＬＩＮ Ｎｉｎｇ１，ＸＩＥ Ａｎ－ｄｅ２，ＷＡＮＧ Ｌｉｎｇ－ｈｕｉ２，ＰＡＮ Ｑｉ－ｌｏｎｇ２，ＱＩＮ Ｗｕ－ｍｉｎｇ２，ＴＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｈｏｎｇ２

（１． Ｌｉｕｗａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｅｓｔ Ｆａｒｍ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｙｕｌｉｎ ５３７８００，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｌｄ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｌｅａｖｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ（１２， ８， ４， ０ ℃） ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｏｎｅ－ｙｅａｒ－ｏｌｄ ｐｏｔ Ｔｓｏｏｎｇｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｏｄｏｒｕｍ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ （ＲＥＣ）， ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ （ＭＤＡ） ｃｏｎｔｅｎｔ， ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ （ＳＯＤ） ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｐｒｏｌｉｎｅ （Ｐｒｏ） ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｔ． ｏｄｏｒｕｍ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｈｅ ＲＥＣ， Ｐｒｏ ａｎｄ sｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ； ｔｈｅ ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｌｉｇｈｔｌｙ， ｂｕｔ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ（２５ ℃）； ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＯＤ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ（４．４３ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ） ａｔ ０ ℃． Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｗ－ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ＲＥＣ， sｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ０．８９４． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ， ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｐｒｏ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔｓｏｏｎｇｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｏｄｏｒｕｍ Ｃｈｕｎ．； ｌｅａｖｅｓ； ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ

觀光木（Ｔｓｏｏｎｇｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｏｄｏｒｕｍ Ｃｈｕｎ．）又名香花木、香木楠、宿軸木蘭，為木蘭科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）觀光木屬（Ｔｓｏｏｎｇｉｏｄｅｎｄｒｏｎ Ｃｈｕｎ）多年生常綠喬木，是中國特有的植物，廣泛分布于福建、廣東、海南、廣西等省（自治區）以及云南省東南部、江西省南部等地區［１］。觀光木以其良好的速生性與豐產性而成為亞熱帶地區極有發展前途的速生用材樹種［２］，而且樹冠濃密、株型優美、花朵漂亮、香氣襲人，是城市園林綠化及景觀建設中具有較高觀賞價值的優良樹種；并且樹干挺直、木材輕軟、結構細、開裂少、易加工，是家俱、樂器和膠合板生產等工業領域的良好用材；在精細化工方面還可提取香料；同時，由于觀光木是中國特有的古老孑遺樹種，對研究古代植物區系、古地理、古氣候都有重要的科學價值；此外，該種為木蘭科的單種屬植物，目前多呈零星分布，數量極少，加上其種子易喪失發芽能力，更新困難，隨著森林的破壞及亂砍濫伐現象的加劇，若不采取有效措施加以保護，有滅絕的危險，現在已處于瀕危狀態，被列為國家二級保護植物［３］。溫度作為重要的環境因子之一，對植物的地域分布和生長發育等方面起著重要的作用。低溫能影響植物的生長代謝，引起相關生理指標的變化。一般認為，脯氨酸（Ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐｒｏ）和可溶性糖（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ）是植物重要的滲透調節物質和防脫水劑，與植物的抗逆性密切相關。其含量的增加有利于提高植物的抗寒性能［４］。目前有關對觀光木的抗寒性研究較少，僅李剛等［５］、方小平等［６］分別對南京市和貴州省的觀光木幼苗的半致死溫度（Ｓｅｍｉｌｅｔｈａｌ ｔｅｍｐｅｒａ－ｔｕｒｅ，ＬＴ５０）、丙二醛（Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量或超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ dｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性進行了探討，尚未見對兩廣地區的觀光木以及結合滲透調節物質如脯氨酸、可溶性糖的含量等生理指標進行過研究。為此，試驗以南寧市的鄉土樹種觀光木幼苗離體枝條上的葉片為材料，研究其在低溫脅迫下的細胞膜透性（Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、ＭＤＡ含量、ＳＯＤ活性以及其他滲透調節物質含量等生理生化指標的變化規律，探索其抗寒機理及抗寒能力，以期為觀光木的遷地保護、栽培和引種馴化等方面提供一定的技術依據。

１ 材料與方法

１．１ 材料及處理

試驗于廣西大學林學院苗圃教學實習基地和實驗室內進行。２０１０年３月２２日將園土和腐殖土按３∶１（體積比）充分混合后，裝入規格為１５ ｃｍ （直徑）×２０ ｃｍ（高） 的花盆中，選用一年生觀光木實生苗進行栽植，每盆１株。９月２０日，在苗高約３５ ｃｍ時，隨機采集長勢良好、無病蟲害的幼苗枝條，裝入密封保鮮袋中帶回實驗室。先用去離子水洗凈枝條和葉片表面的污物，吸水紙吸干水分，然后放入預先設置為２５ ℃的人工氣候箱中進行低溫處理。溫度分別設置為２５（ＣＫ）、１２、８、４、０ ℃共５個不同梯度的處理，每個處理設６個重復；且溫度以２ ℃／ｈ的速度降溫，當溫度降至某一設定值后，保持２４ ｈ，并隨機取葉片測定；然后繼續降溫。降溫期間的環境條件是光照時間為處理日當天８∶００～２０∶００、光照強度為１２０ μｍｏｌ／（ｍ2·ｓ）、空氣相對濕度保持在８０％左右。

１．２ 測定方法

植物細胞膜透性的高低是植物處在逆境條件下細胞膜的完整程度與穩定性的體現，也是衡量植物抗逆性強弱的重要指標之一，在正常情況下，細胞膜對進出細胞的物質具有選擇性透過能力；當植物受到逆境脅迫后，植物的形態結構發生改變，細胞膜受到破壞，膜的透性增加，從而使細胞內的電解質外滲，進而使植物細胞浸提液的相對電導率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ，ＲＥＣ）增大；細胞膜透性增大（相對電導率增大）的水平與受傷害的程度有關［７］。所以細胞膜透性用相對電導率表示，相對電導率采用電導儀法測定［７］；ＭＤＡ含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定［７］，ＳＯＤ活性采用ＮＢＴ光化還原法測定［８］，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定［８］，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定［７］。對試驗所得數據進行方差分析和相關性分析。

２ 結果與分析

２．１ 低溫脅迫對觀光木葉片細胞膜透性的影響

細胞膜是植物抵御低溫脅迫的關鍵結構，對低溫較為敏感，其電解質的變化可顯示細胞膜結構和功能的受損程度［９］。低溫脅迫對觀光木葉片細胞膜透性的影響測定結果見圖１，由圖１可以看出，葉片組織相對電導率隨著溫度的降低逐漸升高，當溫度降至１２ ℃時，相對電導率緩慢增加，為２２．１１％，是對照的１．５４倍；而繼續降低到８ ℃與４ ℃時，相對電導率顯著增加到３７．３８％和５５．５４％，分別是對照的２．６０、３．８７倍；再降到０ ℃時，相對電導率達到６１．７８％，為對照的４．３０倍。說明溫度越低，相對電導率增加的幅度越大，細胞膜受到傷害的程度也就越嚴重。方差分析結果表明，低溫對相對電導率的影響達到了極顯著差異水平（Ｐ＜０．０１）。

２．２ 低溫脅迫對觀光木葉片ＭＤＡ含量的影響

ＭＤＡ是膜脂過氧化的最終產物之一，能嚴重損害植物的細胞膜系統，干擾植物的光合、呼吸及其他代謝過程，其含量的高低是膜脂過氧化程度的重要標志［１０］。低溫脅迫對觀光木葉片ＭＤＡ含量的影響測定結果見圖２，由圖２可見，隨著溫度的降低，葉片ＭＤＡ含量呈先升高后略下降的變化趨勢，但總體含量均高于對照。當溫度降至１２ ℃時，ＭＤＡ含量緩慢增加，為１４．４３ ｎｍｏｌ／ｇ；到８ ℃時，ＭＤＡ含量明顯增加，為２１．８６ ｎｍｏｌ／ ｇ；到４ ℃時達到最大值，為３８．８９ ｎｍｏｌ／ｇ，是對照的２．９１倍，說明此時的膜脂過氧化程度最嚴重；到０ ℃時，ＭＤＡ含量為３３．２４ ｎｍｏｌ／ｇ，比４ ℃時的含量略有下降，可能是此時體內較高的ＳＯＤ活性抑制了膜脂過氧化作用所致。方差分析結果表明，低溫對ＭＤＡ含量的影響呈極顯著差異水平（Ｐ＜０．０１）。

２．３ 低溫脅迫對觀光木葉片ＳＯＤ活性的影響

ＳＯＤ是能清除氧自由基的細胞保護酶，在植物體內可提高植物組織的抗氧化能力，其活性的大小與植物的抗逆性密切相關。低溫脅迫對觀光木葉片ＳＯＤ活性的影響測定結果見圖３。由圖３可以看出，葉片ＳＯＤ活性隨著溫度的降低呈不斷增加的變化趨勢。當溫度降至１２ ℃和８ ℃時，ＳＯＤ活性增加緩慢，分別為５１．５６、６４．９３ Ｕ／ｇ，分別是對照的１．１６、１．４７倍；降到４ ℃之后，ＳＯＤ活性顯著增加；到０ ℃時，ＳＯＤ活性達到１９６．１８ Ｕ／ｇ，是對照的４．４３倍。說明隨著溫度的降低，刺激了ＳＯＤ活性增強。方差分析結果表明，低溫對ＳＤＯ活性的影響達到了極顯著差異水平（Ｐ＜０．０１）。

２．４ 低溫脅迫對觀光木葉片Pro含量的影響

Pro是一種具有高度水溶性的游離氨基酸，作為滲透調節物質，能保持細胞原生質體與環境的滲透平衡，還可穩定生物大分子結構、保持膜結構的完整性［１１］。低溫脅迫對觀光木葉片Pro含量的影響測定結果見圖４，由圖４可見，隨著溫度的降低，葉片Pro含量呈不斷增加的變化趨勢。當溫度降至１２ ℃時，Pro含量顯著增加至５０４．６３ μｇ／ｇ（ＦＷ），為對照的１．１９倍；之后緩慢增加，在０ ℃時，Pro含量達５８７．９６ μｇ／ｇ（ＦＷ），為對照的１．３９倍，說明Pro含量一直保持著較高的水平，這對于細胞抵御低溫脅迫具有一定的積極作用。方差分析結果表明，低溫對Pro含量的影響達到了極顯著差異水平（Ｐ＜０．０１）。

２．５ 低溫脅迫對觀光木葉片可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物體內的重要代謝產物，在抗寒過程中發揮著重要作用。低溫脅迫對觀光木葉片可溶性糖含量的影響測定結果見圖５，由圖５可以看出，隨著溫度的降低，葉片可溶性糖含量不斷增加。其中，當溫度降至１２ ℃時，可溶性糖含量較低，與對照的差異不顯著（Ｐ ＞０．０５）；之后可溶性糖含量顯著增加，在８ ℃和４ ℃時分別為５．９６％、６．０６％；到０ ℃時，可溶性糖含量達６．５２％，為對照的１．３４倍。方差分析結果表明，低溫對可溶性糖含量的影響達極顯著差異水平（Ｐ＜０．０１）。

２．６ 低溫與各生理指標之間的相關性分析

在低溫脅迫下，植物的生理代謝因受到干擾而發生紊亂，使植物受傷甚至死亡。分析低溫與各生理指標之間的相關性，有助于發現低溫與各生理指標之間以及各生理指標之間的緊密聯系程度。低溫脅迫下觀光木葉片各生理指標變化的相關性分析結果見表１，由表１可知，低溫與相對電導率、可溶性糖含量呈顯著的負相關，但與ＭＤＡ含量、ＳＯＤ活性、Pro含量的相關性不顯著；相對電導率與ＭＤＡ含量、ＳＯＤ活性呈顯著的正相關，與可溶性糖含量呈極顯著的正相關。因此，低溫脅迫下可以通過測定植物細胞的相對電導率或可溶性糖含量等指標來間接反映出觀光木的抗寒性能。

３ 小結與討論

Ｌｙｏｎｓ［１２］認為，在低溫脅迫下受到冷害的植物細胞，細胞膜首先發生物相變化，膜脂從液晶態轉變為凝膠態，膜收縮后出現裂縫，造成細胞內含物外滲，導致膜透性增大。與此同時，植物細胞內活性氧代謝的平衡被破壞，有利于活性氧的產生，從而引發或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統的損傷。在試驗中，隨著溫度的降低（從２５ ℃降到４ ℃），觀光木葉片的相對電導率、ＭＤＡ含量不斷升高，可能的原因是在溫度降低時ＳＯＤ活性增加緩慢、酶的活性保持在較低的水平所致，也說明是細胞對低溫環境的一個適應過程；而在０ ℃時，相對電導率升高的程度減緩，ＭＤＡ含量略有下降，此時的ＳＯＤ活性達到最大值，說明一定的低溫能刺激ＳＯＤ活性的大大增強，SOD能夠及時清除體內過多的活性氧自由基，減輕膜脂過氧化引起的膜傷害，保護膜的完整性，從而使觀光木表現出能忍受０ ℃的低溫。同時，這也可能是細胞對低溫脅迫的一種保護性應激反應。這與王永紅等［９］對山茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌ．）的研究結果相一致；但與李晶等［１３］對紅松（Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．）、楊德浩等［１４］對歐洲白樺（Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ Ｒｏｔｈ．）的ＳＯＤ活性研究結果不相一致，可能的原因是不同樹種對于低溫脅迫的抗寒機理或響應機制不一樣所致。相關性分析結果表明，相對電導率與ＭＤＡ含量、ＳＯＤ活性呈顯著的正相關。

一般情況下，植物體內的游離脯氨酸含量并不多；但經低溫脅迫后，其作為細胞內的滲透調節物質、防凍劑或膜穩定劑［１５］會迅速增加含量。不過目前有關脯氨酸的積累與植物抗寒性的關系存在２種不同的觀點，一種認為脯氨酸的積累與植物抗寒性存在著一定的相關性；另一種則認為脯氨酸的積累與植物抗寒性無關。在試驗中，觀光木葉片脯氨酸含量隨著溫度的降低不斷增加，且相關性分析表明，脯氨酸含量與低溫存在著一定的負相關性（相關系數＝－０．８１２）；這與王連敏等［１６］對玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）、黎明等［１７］對香木蓮（Ｍａｎｇｌｉｅｔｉａ ａｒｏｍａｔｉｃａ Ｄａｎｄｙ）的抗寒性研究結果一致。但Ｙｅｌｅｎｏｓｋｙ［１８］在對柑橘（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｂｌａｎｃｏ）的研究中指出，脯氨酸積累與柑橘的抗寒性無關。

可溶性糖作為低溫脅迫下植物細胞的主要滲透調節物質之一，一直被研究者所關注。簡令成［１９］認為，在低溫脅迫初期，植物可能依賴其細胞內可溶性糖含量的增加來抵御低溫傷害；而當脅迫加劇時，可能轉為依靠細胞內蛋白質與核酸的變化和提高來抵御低溫傷害?？扇苄蕴呛颗c植物抗寒性之間存在著相關性［４］。試驗中，觀光木葉片的可溶性糖含量隨著溫度的降低明顯在增加；且相關性分析結果表明，可溶性糖含量與低溫呈顯著的負相關（相關系數＝－０．８９４），這與黎明等［１７］對香木蓮、李曉儲等［２０］對樂昌含笑（Ｍｉｃｈｅｌｉａ ｃｈａｐｅｎｓｉｓ Ｄａｎｄｙ）的研究結果一致。

植物的抗寒性不僅與植物本身的遺傳基因有關，而且還與植物的生長環境有關。李剛等［５］研究表明，南京市一年生觀光木幼苗能忍耐－６ ℃左右的低溫；方小平等［６］研究表明，貴州省二年生觀光木幼苗能忍耐－４ ℃左右的低溫，而本試驗的研究結果卻表明，南寧市一年生觀光木幼苗能忍耐０ ℃左右的低溫，這種差異性可能是觀光木對當地氣候條件適應性的結果或是生長發育階段不同、亦或是低溫處理的溫度不同所導致的。同時本試驗只是在人工模擬低溫條件下對觀光木幼苗離體枝條葉片的抗寒性進行了初步研究，對于其抗寒能力的強弱還需要在田間進行真實性抗寒比較來檢驗。

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