利用電導率儀法檢測泰樂菌素高效降解菌的生長量

摘要：離心收集泰樂菌素降解菌，超聲破碎菌體后，測定不同濃度菌液的電導率值。結果表明，完全破碎后的菌液電導率值與細胞干重存在良好的線性關系，線性系數（Ｒ２＝０．９９９ ８），該方法能快速、準確地分析泰樂菌素降解菌的生長量。

關鍵詞：生長量；泰樂菌素降解菌；電導率

中圖分類號：Ｑ９３－３３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3601-02

Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－Dｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｅｒ

ＸＩＥ Ｌｉ，ＳＵＮ Ｒｕｉ－ｚｈｕ，ＭＡ Ｙｕ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｊｕｎ－ｌｉａｎ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００21， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｌｉｑｕｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｅｎｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｐｅｒｆｅｃｔ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ２＝０．９９９ ８． Ｉｎ ａ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｒｏｗｔｈ ｑｕａｎｔｉｔｙ； ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ

細菌在生長繁殖過程中，可通過測定細菌的生長量，來了解細菌的各種生理生化狀態。目前，細菌生長量的測定主要有４類方法：細胞數目的測量（直接顯微計數法、平板活菌技術、載片培養技術、微孔過濾法、庫爾特計數器、流動細胞光度法、表熒光濾過技術、熒光抗體技術、微型ＥＬＩＳＡ、電子顯微鏡）；細胞量的測量（干重法、比濁法、離心壓縮細胞體積法）；細菌濃度的間接測量（通過測定核酸、蛋白質、多糖、脂質、ＡＴＰ等含量來估算菌濃度，或通過測量Ｃ、Ｎ、Ｏ和Ｐ等元素的含量間接計算菌濃度）；生物量在線檢測（微熱量計法、熒光法、電容／電導／阻抗法等）［１］。其中比濁法檢測成本低、快速，而在線檢測技術準確，可實時分析細菌生長過程中的生長量，因此具有較好的應用前景。該文以早期分離篩選的泰樂菌素降解菌——無丙二酸檸檬酸桿菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）為材料［２］，比較了活菌稀釋計數法、比濁法和電導率法繪制該菌生長曲線的差異，為研究該菌的形態學特征、適應性及泰樂菌素降解機理提供其生長量參數。

１ 材料與方法

１．１ 菌株來源

泰樂菌素降解菌（無丙二酸檸檬酸桿菌，由課題組分離篩選得到并保藏）。

１．２ 培養基和培養條件

酵母浸出粉胨葡萄糖（ＹＰＤ）培養基：酵母提取物１ ｇ，蛋白胨２ ｇ，葡萄糖２ ｇ，水１００ ｍＬ。

培養條件：細胞干重為０．３ ｇ／ｍＬ，１０％接種量，３０ ℃，１２５ ｒ／ｍｉｎ條件下培養。

１．３ 儀器

ＴＧＬ－２０Ｍ型高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、ＤＨＳ１６－Ａ烘干稱量法水分測定儀（上海精密科學儀器有限公司）、ＤＤＳ－１２Ａ型數字式電導率儀（杭州東星儀器設備廠）、ＪＹ９８－ＩＩＩＮ型超聲波細胞粉碎機（寧波新藝超聲設備有限公司）、ＵＶ－１２００型紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）。

１．４ 方法

１．４．１ 干重法 取泰樂菌素降解菌培養液１０ ｍＬ，于１０５ ℃烘干樣品，測定細胞干重，每個樣品測定３次。

１．４．２ 電導率法 取培養４８ ｈ的泰樂菌素降解菌菌液，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃離心２ ｍｉｎ，用去離子水清洗沉淀２次，以去離子水配制成不同濃度的菌液，用烘干稱量法測定細胞干重；采用超聲法破碎降解菌的細胞（５００ Ｗ超聲６次，３０ ｓ／次，２０ ｓ／間隔），超聲后，取０～５．０ ｍＬ系列體積的菌液，以去離子水定容至５．０ ｍＬ。用ＤＤ－１２Ａ型電導率儀測定電導率值，每個樣品測定３次。

１．４．３ 比濁法 采用上述樣品液，于５００ ｎｍ下測定菌液的ＯＤ５００ ｎｍ，每個樣品測定３次。

１．４．4 活菌稀釋計數法［３］ 取０．１ ｍＬ菌液，以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，按１０倍梯度稀釋８個梯度，每個稀釋度涂布ＹＰＤ平板，設３個平行，培養９６ ｈ后，選取１０～３００個菌落數的平板計數。

１．４．5 生長曲線的測定 取４８ ｈ培養后的泰樂菌素降解菌種子液，將種子液按１０％的接種量培養，分別在８～７２ ｈ中，間隔８ ｈ取樣。用活菌計數法測量培養基中細菌濃度，同時以１２１ ℃，滅菌２０ ｍｉｎ的ＹＰＤ培養基為對照，采用比濁法測定菌液濃度，重復３次，計算平均值；分別在８～７２ ｈ間，每間隔４ ｈ取菌液１ ｍＬ，加入裝有３０ ｍＬ去離子水的試管中，同上條件超聲處理，取細胞破碎后的菌液５．０ ｍＬ，用ＤＤ－１２Ａ型電導率儀測定電導率值，每個樣品測定３次，計算平均值。繪制泰樂菌素降解菌培養時間與Ｉｎ（ｃｆｕ／ｍＬ）以及ＯＤ５００ ｎｍ和電導率值的生長曲線。

２ 結果

２．１ 泰樂菌素降解菌的生長曲線

分別采用活菌稀釋計數法、電導率法和比濁法對泰樂菌素降解菌的生長曲線進行測定，結果如圖１，圖２所示。活菌稀釋計數法測定的降解菌生長曲線符合細菌生長的各個階段：０～８ ｈ為降解菌生長的延遲期，８～２４ ｈ為對數生長期，２４～５６ ｈ為穩定期，５６～７２ ｈ為衰亡期。電導率法測定的生長曲線也有明顯的延遲期、對數生長期和穩定期，且延遲期和對數生長期的時間范圍和活菌稀釋計數法相似，但此法所測到的穩定期為２４～７２ ｈ，無衰亡期。而分光光度法的生長曲線始終保持上升狀態，無明顯的延遲期、對數生長期、穩定期和衰亡期。

２．２ 破碎細胞的電導率

早期預試驗中，泰樂菌素降解菌用去離子水清洗和定容后，發現菌液的電導率會隨放置時間延長而增大，初步推測菌體細胞會向外釋放游離電解質。通過超聲波破碎細菌細胞，讓電解質迅速游離出菌體，測定放置不同時間的破碎細胞菌液電導率來驗證上述推斷。

在相同超聲條件下破碎不同體積細菌細胞，在自然冷卻不同時間后，用電導率儀測量菌液電導率，結果見圖３。由圖３可知，在不同時間內，２００ ｍＬ降解菌菌液的電導率變化幅度較大。這是因為不同體積中細菌細胞量不同，采用相同的超聲破碎條件，細胞量越多，析出的電解質越多，進而導致２００ ｍＬ菌液電導率的變化幅度大于５０ ｍＬ菌液。

在不同超聲次數的條件下，相同體積菌液的電導率隨時間的變化結果如圖４。由圖４可知，超聲次數對菌液電導率影響較大。６次超聲處理菌液的電導率隨放置時間的變化為＋０．０１ μＳ／ｃｍ；４次超聲處理菌液的電導率隨放置時間的變化為＋０．４３ μＳ／ｃｍ；２次超聲處理菌液的電導率隨放置時間的變化為＋０．３４ μＳ／ｃｍ，并且放置９０ ｍｉｎ后，２次和４次超聲處理菌液的電導率仍未達到６次超聲處理的水平。故該試驗采用的條件為：取２００ ｍＬ菌液，５００ Ｗ超聲６次，３０ ｓ／次，每次間隔２０ ｓ。在該條件下，泰樂菌素降解菌菌液的電導率值與泰樂菌素降解菌細胞干重存在良好的線性關系（圖５）。

３ 小結與討論

由于菌體細胞的性狀特征和培養基組分影響，可采用電導率法來替代比濁法測定細菌的生長曲線和生長量。因為在菌體細胞含量較大時，在液體培養基中容易下沉，采用比濁法會存在一定誤差，另外，培養基的成分也會干擾細菌細胞的滲透情況，進而影響菌液的折射率以及渾濁程度。而采用濁度法時，不超過０．６５的吸光度才與菌體間存在較好的線性關系，而采用電導率值分析細菌生物量則沒有此類限制。由于細胞計數法、細胞干重和濕重法、活菌計數法（平板菌落計數、ＭＰＮ法、試劑紙法、膜過濾等）以及測定生理指標法（定氮和ＤＮＡ含量測定）操作繁瑣且耗時耗能，因此，采用快速準確的電導率法，將有較好的應用前景。

電導率值之所以能夠較為準確地反映降解菌的生長量，主要有兩個原因：其一，細胞釋放了無機鹽離子，其二，細胞中不導電的生物大分子物質在細胞內的各種物質代謝過程中分解成了導電的小分子物質［４］，但采用電導率法時，其電信號會受到培養基成分、ｐＨ、氣泡等因素干擾［５］。為此，筆者發現采用去離子水清洗并稀釋菌液，可較好地減少干擾。綜上所述，采用電導率法能夠準確快速地測定泰樂菌素降解菌的生長量，該方法的建立將為篩選泰樂菌素藥渣中的降解菌株提供較好的評價方法。

參考文獻：

［１］ 沈 萍，陳向東．微生物學［Ｍ］． 第二版．北京：高等教育出版社，２００６．１５１－１５４．

［２］ 劉力嘉，謝 麗，張作義，等．泰樂菌素高效降解菌的篩選及降解特性研究［Ｊ］．農業環境科學學報，２０１１，３０（５）：１０２７－１０３０．

［３］ 任曉燕，剡根強，周 霞．糞腸球菌生長曲線的測定［Ｊ］．獸醫雜志，２００５，２４（６）：１０－１１．

［４］ ＳＶＥＮＳＳＯＮ Ｕ Ｋ． Ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Dａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，７７（１２）：３５１６－３５２３．

［５］ ＳＩＮＧＨ Ａ， ＫＵＨＡＤ Ｒ Ｃ， ＳＡＨＡＩ Ｚ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ［Ｊ］． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５１：４７－７０．