廬山石韋和柔軟石韋營養葉片組織化學定位研究

摘要：利用冰凍切片法對廬山石韋和柔軟石韋營養葉片中的皂苷類化合物、蒽醌類化合物及多糖物質進行了組織化學定位研究。結果表明，皂苷類化合物主要積累在營養葉片主脈的薄壁組織和葉片的柵欄組織中，海綿組織、厚角組織、表皮中也有少量皂苷類化合物分布；蒽醌類化合物主要分布在營養葉片主脈的薄壁組織以及葉肉同化組織中，在表皮和韌皮部含有少量的蒽醌類化合物，木質部無明顯顯色反應；而多糖物質普遍存在于葉肉同化組織中。從顯色程度上看，廬山石韋皂苷類化合物和多糖物質含量高于柔軟石韋，而柔軟石韋的蒽醌類化合物含量則高于廬山石韋。這為石韋資源的合理利用提供了參考依據。

關鍵詞：廬山石韋；柔軟石韋；營養葉片；皂苷類化合物；蒽醌類化合物；多糖物質；組織化學定位

中圖分類號：Ｑ９４９．３６＋７．２；Ｑ９４４．５６；Ｑ９４６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3540-05

Histochemical Localization of Foliage Leaves of Pyrrosia sheareri and P. porosa

ＺＨＯＮＧ Ｘｉａ－ｊｕｎ１，ＬＩ Ｙａｎ－ｑｕｎ２，ＨＵＡＮＧ Ｒｏｎｇ－ｓｈａｏ３

（１． Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｇｕａｎｇｘｉ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００１，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｒｏｚｅｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｌｏｃａｔｅ ｓａｐｏｎｉｎｓ， ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｌｉａｇｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｓｉａ ｓｈｅａｒｅｒｉ（Ｂａｋ．） Ｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ｐ． ｐｏｒｏｓａ（Ｃ． Ｐｒｅｓｌ） Ｈｏｖｅｎｋ． Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｍａｉｎｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｖｅｉｎ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｌｉｓａｄｅ ｔｉｓｓｕｅ， ｓｏｍｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｓｐｏｎｇｙ ｔｉｓｓｕｅ， ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ａｎｄ ｐｈｌｏｅｍ． Ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｖｅｉｎ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ｓｏｍｅ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ａｎｄ ｐｈｌｏｅｍ； ｎｏ ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｘｙｌｅｍ． Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ． ｓｈｅａｒｅｒｉ ａｎｄ Ｐ． ｐｏｒｏｓａ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｐ． ｓｈｅａｒｅｒｉ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ Ｐ． ｐｏｒｏｓａ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｐ． ｐｏｒｏｓａ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｄａｔａ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｎａｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｒｏｓｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｙｒｒｏｓｉａ ｓｈｅａｒｅｒｉ （Ｂａｋ．） Ｃｈｉｎｇ； Ｐ． ｐｏｒｏｓａ （Ｃ． Ｐｒｅｓｌ） Ｈｏｖｅｎｋ； ｆｏｌｉａｇｅ ｌｅａｖｅｓ； ｓａｐｏｎｉｎｓ； ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ； ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ

廬山石韋［Ｐｙｒｒｏｓｉａ ｓｈｅａｒｅｒｉ（Ｂａｋ．）Ｃｈｉｎｇ］和柔軟石韋［Ｐ． ｐｏｒｏｓａ（Ｃ． Ｐｒｅｓｌ）Ｈｏｖｅｎｋ］為水龍骨科（Ｐｏｌｙｐｏｄｉａｃｅａｅ）石韋屬（Ｐｙｒｒｏｓｉａ Ｍｉｒｂｅｌ）多年生草本植物，主要分布于我國廣西、廣東、貴州、云南、四川、浙江、江西、湖北、福建及臺灣等省（自治區），多生于山野的巖石上或樹上；外形上常按葉型大小不同，分為大葉石韋類和小葉石韋類兩個類群。廬山石韋為大葉石韋，已被《中華人民共和國藥典》收藏為正品石韋；而柔軟石韋為小葉石韋，為非中國藥典藥品。這兩類石韋在臨床應用上也各有側重點，小葉石韋主要對腎炎、尿道炎有一定的療效［１－４］，而大葉石韋則對氣管炎療效較好［５］。石韋屬植物含皂苷、延胡索酸、咖啡酸、香草酸、蒽醌苷、黃酮類、鞣質、β－谷甾醇和綠原酸等多種藥用成分［６－１２］。目前在化學成分［１３］、形態結構［１４，１５］、含量測定［１６－１８］和藥理［１９］等方面報道不少，但有關廬山石韋和柔軟石韋藥用成分的組織化學定位以及積累研究鮮見報道。為了比較不同石韋類群化學成分在組織器官中的含量差異及其分布，試驗通過對廬山石韋和柔軟石韋主要藥用部位營養葉片中皂苷類化合物、蒽醌類化合物及多糖物質進行了組織化學定位研究，以期為研究石韋中藥材中的皂苷類化合物、蒽醌類化合物以及多糖物質的合成、轉運和貯存的途徑提供試驗依據，同時為藥用石韋資源的合理利用提供參考。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

柔軟石韋于２００７年７月采自廣西壯族自治區靖西縣安德鎮；廬山石韋于２００７年７月采自環江毛南族自治縣愛峒鄉，均取生長正常的成熟營養葉片為研究材料。在廣西大學農學院中心實驗室進行測定工作，所用試劑有５％香草醛、冰醋酸、高氯酸、醋酸鉛飽和溶液、３８％甲醛、７０％酒精、５％ＮａＯＨ溶液、高碘酸酒精、席夫試劑（Ｓｃｈｉｆｆ＇ｓ ｒｅａｇｅｎｔ，品紅亞硫酸試劑）等。儀器主要是廣西大學農學院中心實驗室已具備的Ｌｅｉｃａ－ＤＭＬＢ顯微鏡、植物切片機等。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 皂苷類化合物檢測（香草醛－冰醋酸和高氯酸等量混合的顯色劑測定） 將新鮮營養葉片采用冰凍切片法橫切制成２５ μｍ的薄片，在醋酸鉛飽和溶液中浸泡２４ ｈ后，滴加等量的５％的香草醛－冰醋酸和等量高氯酸混合的顯色劑，顯色５ ｍｉｎ后，觀察葉片組織有無產生從淡紅色→紅色→紫紅色的顏色變化。對照材料用３８％甲醛 ５ ｍＬ＋冰醋酸５ ｍＬ＋７０％酒精９０ ｍＬ配制的ＦＡＡ固定液浸泡２０ ｄ，以除去皂苷類化合物，再用上述混合劑顯色，制成裝片，用Ｌｅｉｃａ－ＤＭＬＢ顯微鏡進行觀察并照相。

１．２．２ 蒽醌類化合物檢測（氫氧化鈉溶液顯色法） ①將新鮮營養葉片采用冰凍切片法橫切制成２５ μｍ的薄片，放在載玻片上，滴上去離子水后蓋上蓋玻片，置顯微鏡下直接觀察并拍照。②在前述①的裝片上滴５％ＮａＯＨ溶液顯色，加蓋玻片后在Ｌｅｉｃａ－ＤＭＬＢ顯微鏡下觀察顯色部位，并照相。

１．２．３ 多糖物質檢測 采用高碘酸席夫染色法（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－ｓｃｈｉｆｆ ｓｔａｉｎ，ＰＡＳ），將新鮮營養葉片采用冰凍切片法橫切制成２５ μｍ的薄片，在高碘酸酒精溶液中處理３ ｍｉｎ，在７０％酒精中漂洗后滴加席夫試劑處理１ ｍｉｎ，流水沖洗５ ｍｉｎ后，封片，最后在Ｌｅｉｃａ－ＤＭＬＢ顯微鏡下觀察并照相。

２ 結果與分析

２．１ 皂苷類化合物檢測

試驗采用的皂苷類化合物顯色劑是香草醛－冰醋酸和高氯酸混合劑，該顯色劑能與植物中的皂苷類化合物發生化學反應，生成大分子復合物，并且出現特定的顯色反應，因此是對植物所含皂苷類化合物定性的一種識別試劑。以５％香草醛－冰醋酸和高氯酸混合劑作為顯色劑滴加后，含有皂苷類化合物的細胞會呈現出淡紅→紅→紫紅的顏色變化，顏色的深淺與皂苷類化合物的含量呈正相關關系［２０－２３］。從鏡檢結果（圖１）來看，石韋植物不同種及同種的營養葉片中不同組織部位，其皂苷類化合物的分布和積累情況是不同的。在柔軟石韋和廬山石韋營養葉片主脈橫切面薄壁組織和維管束韌皮部均顯示出紅色物質（圖１－１、圖１－４），說明有皂苷類化合物的存在；厚角組織則顯示極淺的紅色（圖１－１、圖１－４），說明此處含少量的皂苷類化合物，而木質部顯色不明顯。在營養葉片的整個橫切面中均有皂苷類化合物分布，其中柵欄組織積累最多，顯色最明顯，并且呈紫紅色（圖１－２、圖１－５），表明柵欄組織有較多的皂苷類化合物存在；葉表皮和海綿組織呈淺紅色，反映出含皂苷類化合物相對較少（圖１－２、圖１－３、圖１－５），并且表皮毛顯色不明顯。研究發現，廬山石韋柵欄組織顯色比柔軟石韋柵欄組織明顯，呈紫紅色，表明廬山石韋營養葉片皂苷類化合物含量比柔軟石韋含量高。而經７０ ％的酒精配制的ＦＡＡ固定液處理的對照材料與顯色劑沒有明顯的顯色反應．說明皂苷類化合物已被ＦＡＡ液抽提。

２．２ 蒽醌類化合物檢測

試驗采用的蒽醌類化合物顯色劑是５％ ＮａＯＨ溶液，該顯色劑能與植物中的蒽醌類化合物發生化學反應，生成大分子復合物，并且出現特定的顯色反應，因此是對植物所含蒽醌類化合物定性的一種識別試劑。在石韋植物營養葉片橫切面切片上滴加５％ ＮａＯＨ溶液后，會立即產生特定的顯色反應，出現顏色從淡黃色至橘紅色或深紅色不等的變化。從鏡檢結果（圖２）來看，石韋植物不同種及同種的營養葉片的不同組織部位中，蒽醌類化合物的分布和積累情況也是不同的。在柔軟石韋和廬山石韋營養葉片主脈橫切面上，顯色部位主要集中在薄壁組織，上有較多細胞染成紅色（圖２－１、圖２－２、圖２－４），表明該組織含較多的蒽醌類化合物；而表皮部位顯淺紅色（圖２－１、圖２－２、圖２－5），說明蒽醌類化合物含量少；維管束的韌皮部顯色而木質部的導管不顯色，厚角組織也無明顯的顯色反應（圖２－１、圖２－２、圖２－４），說明它們不含蒽醌類化合物或蒽醌類化合物的含量極低。在營養葉片的柵欄組織和海綿組織中均可看到明顯的顯色反應，而且有許多細胞染成了深紅色（圖２－３、圖２－５），特別是在柔軟石韋海綿組織中有較多的細胞呈深紅色（圖２－３），表明在柔軟石韋海綿組織中分布有較多的蒽醌類化合物。據顯色的深淺判斷，柔軟石韋營養葉片中的蒽醌類化合物含量要比廬山石韋的高。

在未加５％ ＮａＯＨ溶液的石韋植物營養葉片橫切面上，同化薄壁組織含有葉綠素，因而呈綠色（圖3-1、圖３－２、圖３－４）；表皮不具葉綠體，為白色（圖３－２、圖３－４）；主脈厚角組織和維管束中含有黃色物質，呈黃色（圖３－１、圖３－３）。

２．３ 多糖物質

冰凍切片經過ＰＡＳ染色后，會立即產生特定的顯色反應，變色范圍從淡紅色至深紅色或紫紅。鏡檢結果表明，營養葉片除了厚角組織被染成紅色外，主脈薄壁細胞、維管束和柵欄組織、海綿組織以及表皮毛等部位顯色較均勻，也呈紅色（圖４－１、圖４－２、圖４－３、圖４－４），說明柔軟石韋和廬山石韋營養葉片中都含有較多的多糖物質。

在未經PAS染色直接用顯微鏡觀察的廬山石韋和柔軟石韋營養葉片切片中，同化薄壁組織含有葉綠素，呈綠色（圖3-1、圖３－２、圖３－４）；表皮不具葉綠體，為白色（圖３－２、圖３－４）；柔軟石韋主脈厚角組織呈無色，而廬山石韋主脈厚角組織和維管束中含有淡黃色物質，呈淡黃色（圖３－１、圖３－３）。

３ 小結與討論

１）應用組織化學定位技術來確定藥用成分在中藥材中的分布和積累是一種有效的研究手段。皂苷類化合物、蒽醌類化合物、多糖物質是石韋屬植物中的主要藥用成分。皂苷類化合物是一類具有較強生理活性的次生代謝產物，其在不同藥材、不同植物組織器官及不同發育時期存在很大的差異［２４－２６］。林如等［２７］對絞股藍［Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｍａｋ．］的葉片皂苷類化合物進行了定位，結果表明葉肉組織和葉脈韌皮部顯紫紅和紅色，表皮和厚角組織顯淺紅色。本試驗結果也表明，廬山石韋和柔軟石韋營養葉片的主脈薄壁組織、維管束韌皮部、厚角組織、表皮、柵欄組織和海綿組織中均有不同含量的皂苷類化合物分布，而表皮毛和維管束木質部顯色不明顯。彭華勝等［２８］研究發現，栽培太子參［Ｐｓｅｕｄｏｓｔｅｌｌａｒｉａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｍｉｑ）Ｐａｘ ｅｘ Ｐａｘ ｅｔ Ｈｏｆｆｍ．］塊根在次生韌皮部與形成層中的皂苷類化合物含量明顯高于次生木質部。Ｎｏｂｕｙｕｋｉ等［２９］認為，蒽醌類化合物存在于葉片表皮下方的同化薄壁組織中。而Ｂｒｕｎｉ等［３０］認為中央貯水組織也是積累蒽醌類化合物的場所，Ｂｅａｕｍｏｎｔ等［３１］認為蒽醌類化合物可能貯存于維管束中。從本研究的結果來看，比較支持Ｎｏｂｕｙｕｋｉ的觀點，檢測顯示，蒽醌類化合物主要分布在石韋屬植物營養葉片主脈的薄壁組織及葉肉同化組織中，維管束的韌皮部顯色，而木質部不顯色，據此我們推測蒽醌類化合物的運輸可能是通過韌皮部進行的，當然還有待進一步研究確認。葉片是植物進行光合作用合成糖類物質的重要器官，呂洪飛等［３２］在石斛屬（Dendrobium Sw.）植物葉片多糖物質的組織化學定位研究中，發現葉片里染色較深的部位在葉肉細胞、表皮細胞的細胞質及韌皮部細胞的細胞壁上。章英才等［３３］在研究了大黃（Rheum tanguticum Maxim et Balf var. liupanshanense Cheng et Kao）莖和葉中多糖貯藏分布特征后認為，葉肉柵欄組織和海綿組織細胞內分布有大量的葉綠體，糖類物質在葉肉細胞中合成，進行短暫的貯存后通過一定的途徑經由葉柄和莖維管束運輸至根莖或根中貯藏積累。本研究也發現廬山石韋和柔軟石韋營養葉片中含有較多的多糖物質，但是否運輸至石韋葉柄和根狀莖中貯藏積累及其運輸途徑還有待進一步確認。

２）張藝軒等［１３］利用高效液相色譜技術研究大葉石韋和小葉石韋的指紋圖譜，發現大葉石韋（廬山石韋）與小葉石韋［有柄石韋，Pyrrosia petiolosa （Ｃｈｒｉｓｔ）Ｃｈｉｎｇ］的指紋圖譜有較大的差異。我們的研究表明，廬山石韋和柔軟石韋營養葉片中存在著大量的皂苷類化合物、蒽醌類化合物和多糖物質，它們在石韋植物營養葉片中的分布是多位點的，不同組織中有一定的貯藏與分布；根據不同組織中細胞的顯色程度不同，廬山石韋和柔軟石韋營養葉片中皂苷類化合物、蒽醌類化合物和多糖物質的含量差異也較大，廬山石韋營養葉片的皂苷類化合物和多糖物質含量比柔軟石韋營養葉片的高，而柔軟石韋營養葉片的蒽醌類化合物含量則高于廬山石韋的。《中華人民共和國藥典》中只收錄了石韋［Ｐｙｒｒｏｓｉａ ｌｉｎｇｕａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｆａｒｗ．］、廬山石韋、有柄石韋這３種石韋植物作為傳統中藥石韋的原植物［３４］，但據本研究發現，柔軟石韋營養葉片具有較高的蒽醌類化合物含量，而蒽醌類化合物是一類具有重要藥用價值的中藥有效成分，具有抗菌消炎、健胃、強壯、通經、利尿、祛瘀血、抗腫瘤等作用［３５－４３］。加上隨著醫療事業的發展，石韋藥材的用藥量在不斷增加，這造成野生資源的急劇減少。不過據調查，柔軟石韋的野生資源在廣西壯族自治區各地還比較豐富［４４］，有較好的利用價值。本研究也可為合理開發利用石韋資源提供參考依據。

３）試驗對廬山石韋和柔軟石韋營養葉片采用氫氧化鈉溶液顯色法進行了蒽醌類化合物的組織定位、采用ＰＳＡ染色法對多糖物質進行了組織定位、采用香草醛－冰醋酸和高氯酸等量混合劑顯色法對皂苷類化合物進行了組織定位，３種方法都成功地產生了從淡色－深色的復合顯色變化，顯示出廬山石韋和柔軟石韋營養葉片中有皂苷類化合物、蒽醌類化合物以及多糖物質的存在，且不同組織中顏色深淺不同，其色度變化與石韋活性成分含量呈正比關系，顯色反應靈敏，完全可以作為快速定性識別、定位檢測石韋屬植物營養葉片中的皂苷類化合物、蒽醌類化合物以及多糖物質的方法應用。

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