睪酮多克隆抗體的制備及免疫學檢測方法的建立

摘要：采用優化的碳化二亞胺法制備睪酮（ＴＥＳ）人工抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，建立間接競爭ＥＬＩＳＡ標準曲線。標準曲線在ＰＢＳ中的線性檢測范圍為０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，相關系數Ｒ２＝０．９７２ ２，半數抑制濃度（ＩＣ５０）為２．８00 ｎｇ／ｍＬ，最低檢測限（ＬＯＤ）為０．０３５ ｎｇ／ｍＬ；抗體與去甲睪酮的交叉反應率為２２．３％，與其他檢測化合物的交叉反應很小或忽略不計。羊尿２０倍稀釋后進行添加回收試驗，其添加值與檢測值的相關系數為０．９８５ ２。因此，該免疫學方法可用于動物尿液中睪酮殘留水平的定量分析。

關鍵詞：睪酮；人工抗原；多克隆抗體；間接競爭ＥＬＩＳＡ

中圖分類號：Ｓ８５９．７９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3554-03

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ

ＬＩ Ｃｈａｏ－ｙｉｎｇ１，２，ＪＩＡＮＧ Ｊｉｎ－ｑｉｎｇ２，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｙｕｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｉｎ－ｍｉｎｇ２，ＷＵ Ｓｈｉ－ｘｉｕ２， ＬＩＵ Ｍｉｎｇ－ｃｈｅｎｇ２

（１． Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｉｃＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＴＥＳ） ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＴＥＳ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ （ＥＤＣ） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｉｎ ＰＢＳ ｗａｓ ｆｒｏｍ ０．０９６ ｔｏ ９２．２00 ｎｇ／ｍＬ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ （Ｒ２） ｗａｓ ０．９７２ ２， ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ） ａｎｄ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ０．０３５ ｎｇ／ｍＬ ａｎｄ ２．８00 ｎｇ／ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｗａｓ ２２．３％ ａｎｄ ｓｌｉｇｈｔ ｏｒ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｕｎｄｅｒ ２０－ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｕｒｉｎｅ， ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ０．９８５ ２ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＴＥＳ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ； ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ

類固醇激素是生物體內產生的一類調節機體代謝功能的微量物質，又稱化學信息素。此類物質有較強的蛋白質同化作用，可以提高蛋白質沉積，降低脂肪含量，從而提高飼料轉化效率［１］。睪酮是哺乳動物體內常見的具有雄激素作用的類固醇激素，它可以增加肌肉含量，提高骨骼強度，并在雄性生殖器官的發育中發揮重要作用，因而在臨床醫學中得到應用。外源性睪酮也被運動員非法使用，以提高比賽成績；養殖場使用睪酮激素后，可以提高經濟效益。然而，長期攝入睪酮類激素會導致消費者內分泌紊亂、性早熟，大大增加致癌、致畸的風險［２］。因此，自１９８６年以來，歐盟委員會就禁止在肉食性動物養殖中以促進生長為目的使用自然或人工合成的激素，以保護消費者可能因食用激素的殘留物或其代謝物而引起的發育問題、神經問題、遺傳毒性和癌癥問題［３］。睪酮傳統的理化檢測方法包括液相色譜－質譜（ＬＣ－ＭＳ）［１，４］和氣相色譜－串聯質譜（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）［５］等方法。這些方法靈敏度高、特異性強，但樣品前處理繁瑣，不適合大批量的市場監測要求。而免疫學檢測方法建立在抗體對抗原的分子識別上，其主要優點是親合力高、快速、簡單、經濟實用，能夠實現對生物液體的小體積、大批量檢測，逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速檢測的方法之一［６］。

本研究以睪酮標準品為起始反應物，經過一系列化學反應制備人工抗原，通過免疫新西蘭大白兔獲得兔抗睪酮的血清，建立間接競爭ＥＬＩＳＡ檢測方法。該研究可以優化液質聯用和氣質聯用等理化方法的樣品前處理過程，同時為免疫檢測試劑盒和試紙條的研制提供基礎。

１ 材料與方法

１．１ 試劑與材料

睪酮（ＴＥＳ）、１９－去甲睪酮、勃地酮、雌二醇、群勃龍、甲睪酮、醋酸氯睪酮等標準品購自德國Ｄｒ公司；碳化二亞胺（ＥＤＣ）、弗氏完全佐劑（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐劑（ＦＩＡ）由美國Ｐｉｅｒｃｅ公司生產；Ｎ－羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）由日本株式會社生產；琥珀酸酐、牛血清白蛋白（ＢＳＡ，ＭＷ６７ ０００）、雞卵清蛋白（ＯＶＡ，ＭＷ４５ ０００）、羊抗兔酶標二抗（ＧａＲＩｇＧ－ＨＲＰ）、透析袋等購自華美生物工程公司，其他試劑均為分析純。

１．２ 儀器與設備

ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＭＫ３酶標儀和ＧＳ１５Ｒ高速冷凍離心機（美國Ｔｈｅｒｍｏ公司）；ＤＵ８００核酸蛋白分析儀（美國Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）；ＳＺ－９７自動三重蒸餾水器（上海雅榮生化儀器有限公司）；ＰＨＳ－３ＴＣ精密酸度計（上海天達儀器有限公司）。

１．３ 人工抗原的合成

參照文獻［３］，采用優化的ＥＤＣ兩步法合成ＴＥＳ人工抗原（圖１）。準確稱取ＴＥＳ ８８ ｍｇ溶于６ ｍＬ無水吡啶，然后加入１５０ ｍｇ的琥珀酸酐，５０ ℃避光攪拌反應２４ ｈ。氮吹儀吹干吡啶，獲得淡黃色油脂狀物，５％ ＮａＨＣＯ３溶解后，用乙醚洗滌２次，然后用Ｈ２ＳＯ４進行酸化。離心后棄上清液，殘余物用無水硫酸鈉干燥，并用乙醚重結晶搗碎，揮發干溶劑所得淡黃色固體物即為半抗原ＴＥＳ琥珀酸酯。

將３８ ｍｇ ＴＥＳ琥珀酸酯用３ ｍＬ Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）溶解后，加入１２ ｍｇ ＮＨＳ 和 ３８ ｍｇ ＥＤＣ，３７ ℃條件下避光反應２４ ｈ。離心后取上清液逐滴加入到５ ｍＬ含６６ ｍｇ ＢＳＡ（或４０ ｍｇ ＯＶＡ）的ＰＢＳ緩沖液中，３７ ℃條件下避光振蕩反應６ ｈ。反應完成后先用蒸餾水透析３ ｄ，再用ＰＢＳ透析３ ｄ，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時分裝于安瓿瓶中，－２０ ℃凍干保存。用ＤＵ８００核酸蛋白分析儀掃描人工抗原，進行紫外掃描圖譜鑒定。

１．４ 多克隆抗體的制備

參照文獻［７］和［８］的方法，制備兔抗ＴＥＳ多克隆抗體。首免用等體積ＦＣＡ乳化免疫抗原，劑量為５００ μｇ／只（以載體蛋白含量計算）。以后每隔４周加強免疫１次，改用ＦＩＡ乳化，共強化免疫４次。５免后１０ ｄ心臟采血，室溫靜置２ ｈ，４℃過夜后離心，收集上清，飽和硫酸銨三步鹽析法純化抗體。多克隆抗體加入疊氮鈉（V／V，０．０２％）后分裝，－７０ ℃保存備用。

１．５ 免疫學檢測方法的建立

間接ＥＬＩＳＡ和間接競爭ＥＬＩＳＡ操作程序參考文獻［９］。方陣滴定法優化檢測抗原（ＴＥＳ－ＯＶＡ）濃度和多抗（ＴＥＳ ｐＡｂ）稀釋倍數，以Ｂ／Ｂ０值（Ｂ是標準品不同稀釋度時Ａ４５０ nm值，Ｂ０是不加標準品時Ａ４５０ nm值）為縱坐標，以標準品不同稀釋度的對數值為橫坐標，擬合建立間接競爭ＥＬＩＳＡ標準曲線，進行相關分析。靈敏度用ＩＣ５０值表示，代表標準品與檢測抗原偶聯時的半數抑制濃度；線性范圍表示最大信號值２０％～８０％的抑制率（ＩＣ２０－ＩＣ８０）；最低檢測限（ＬＯＤ）以ＩＣ１５值計算［１０］。抗體特異性以交叉反應率（ＣＲ）表示［３］，計算公式是：ＣＲ=■×１００%，ＣＲ越低，抗體特異性越強。

１．６ 添加回收試驗

將２０ ｍＬ羊尿充分搖勻，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ后取上清液，然后用ＰＢＳ稀釋１０倍后直接檢測。用甲醇配制ＴＥＳ標準品母液，再用ＰＢＳ稀釋成不同的加標濃度檢測液，比較添加值和ＥＬＩＳＡ檢測值之間的相關關系（相關系數），驗證免疫學檢測方法的有效性。

２ 結果與分析

２．１ 人工抗原紫外特征

在２２０～４００ ｎｍ紫外光區分別對ＴＥＳ、ＢＳＡ和ＴＥＳ－ＢＳＡ進行紫外掃描，結果如圖２所示。ＴＥＳ的最大吸收峰在２４８ ｎｍ，ＢＳＡ的最大吸收峰在２７９ ｎｍ，而ＴＥＳ－ＢＳＡ人工抗原的特征吸收峰發生了明顯的偏移，其紫外光譜具有明顯的ＴＥＳ和ＢＳＡ疊加的特性，證明偶聯成功。

２．２ 間接競爭ＥＬＩＳＡ標準曲線

依據檢測抗原和多克隆抗體用量少的原則，選擇Ａ４５０ nm值為１．５～２．０左右時，檢測抗原和ＴＥＳ ｐＡｂ的最大稀釋倍數為理想工作濃度（數據未顯示），因此確定本試驗體系ＴＥＳ－ＯＶＡ最佳包被質量濃度為２ μｇ／ｍＬ，抗ＴＥＳ ｐＡｂ的最佳工作的稀釋度為１∶１０４。優化的間接競爭ＥＬＩＳＡ標準曲線如圖３所示，該曲線的回歸方程式為ｙ＝－９．８１７ 0 ｌｎｘ＋４８．２３６ 0（Ｒ２＝０．９７２ ２），ＩＣ５０為２．８ ｎｇ／ｍＬ，表明ＴＥＳ ｐＡｂ具有較高的靈敏度。根據公式計算出標準曲線在ＰＢＳ中的線性檢測范圍為０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，最低檢測限為０．０３５ ｎｇ／ｍＬ。

２．３ 抗體特異性

特異性是免疫測定方法中的固有現象，通過測定各種物質的ＩＣ５０值，然后計算其交叉反應率（ＣＲ）。因此，在間接競爭ＥＬＩＳＡ檢測過程中，用蛋白同化激素結構類似物代替ＴＥＳ標準品溶液，測定不同競爭物的ＩＣ５０值，計算交叉反應率，結果見表１。從結果來看，去甲睪酮（２２．３％）與ＴＥＳ有較大的交叉反應，這說明ＴＥＳ甾環結構上Ａ和Ｂ環對其性質影響較大。而其他競爭物的交叉反應率很小或沒有，說明其競爭物的三維結構差異較大。結果表明，該免疫學方法可用于ＴＥＳ殘留水平的檢測。

２．４ 添加回收試驗

將羊尿稀釋２０倍后添加不同濃度的ＴＥＳ標準品溶液，比較添加濃度和檢測值之間的相關系數，其結果見圖４。由圖4可知，數據點分布于趨勢線的兩側，檢測回歸方程式為ｙ＝０．９１８ ６ ｘ＋１．４５６ ９（Ｒ２＝０．９８５ ２）。這表明本研究建立的ＥＬＩＳＡ檢測值具有較高的符合性，可用于動物源樣品中ＴＥＳ含量分析的大量篩選。

３ 結論

人工抗原能否刺激動物產生針對半抗原的特異性抗體，是判斷人工抗原合成成敗的關鍵。本試驗利用合成的免疫原（ＴＥＳ－ＢＳＡ）對新西蘭大白兔進行免疫，并對抗體進行了初步評價。結果表明，合成的人工抗原能有效刺激機體產生特異性免疫應答，獲得了較高效價的多克隆抗體，抗體的特異性好、親和力強，可滿足動物性食品中ＴＥＳ的安全評價需要。抗ＴＥＳ多克隆抗體的制備為建立體液中ＴＥＳ殘留檢測的ＥＬＩＳＡ方法及開發ＴＥＳ快速檢測試劑盒奠定了基礎。

參考文獻：

［１］ 牛晉陽，孫 煥，李瑩瑩． 高效液相色譜－串聯質譜法測定豬肉中１０種類固醇類激素殘留［Ｊ］． 食品科學，２０１０，３１（４）：２３０－２３２．

［２］ ＤＡＥＳＥＬＥＩＲＥ Ｅ， ＶＡＮＤＥＰＵＴＴＥ Ｒ， ＰＥＴＥＧＨＥＭ Ｃ Ｖ． Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｂｏｌｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｂｙ ＧＣ－ＭＳ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｃａｔｔｌｅ ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｓｔ，１９９８，１２３（１２）：２５９５－２５９８．

［３］ 姜金慶，張海棠，李廣領，等． １９－去甲睪酮人工抗原及免疫學特性［Ｊ］． 農業生物技術學報，２０１０，１８（５）：７２５－７３１．

［４］ ＳＨＡＯ Ｂ， ＺＨＡＯ Ｒ， ＭＥＮＧ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｈｏｒｍｏｎａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎ ｍｅａｔ， ｋｉｄｎｅｙ， ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００５，５４８（１－２）：４１－５０．

［５］ ＨＡＲＴＭＡＮＮ Ｓ， ＳＴＥＩＮＨＡＲＴ Ｈ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｍｅａｔ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，１９９７，７０４（１－２）：１０５－１１７．

［６］ 李超英，姜金慶．諾氟沙星單克隆抗體的制備及初步應用［Ｊ］． 食品工業科技，２０１１，３２（９）：２１０－２１３．

［７］ 張紅琳，陳昌云，周紅霞，等．抗萊克多巴胺多克隆抗體的制備［Ｊ］． 湖北農業科學，２０１１，５０（９）：１８３６－１８４１．

［８］ 姜金慶，楊雪峰，王自良，等． 氟喹諾酮類藥物多殘留免疫學檢測方法的建立［Ｊ］． 中國預防獸醫學報，２０１１，３３（１１）：８８７－８９２．

［９］ ＪＩＡＮＧ Ｊ Ｑ， ＺＨＡＮＧ Ｈ Ｔ， ＬＩ Ｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－lｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｕｒｉｎｅｓ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１１，４４（１４）：２３７３－２３９３．

［１０］ ＪＩＡＮＧ Ｊ Ｑ， ＺＨＡＮＧ Ｈ Ｔ， ＷＡＮＧ Ｚ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ １９－ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５９（１８）：９７６３－９７６９．