中溫木聚糖酶高產真菌菌株篩選及產酶條件

摘要：利用以木聚糖作為惟一碳源的基礎鹽培養基，在３０℃培養條件下，從新鄉周邊土樣及腐殖質中篩選到１株β－木聚糖酶高產真菌菌株（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８）。該菌株在２０～４０ ℃生長良好，最適生長溫度３０ ℃。產酶培養條件優化結果表明，在培養溫度為３０ ℃，培養基初始ｐＨ ６．０，以玉米芯為碳源，以蛋白胨、酵母粉和玉米漿為有機氮源，發酵４ ｄ，木聚糖酶活性達５６２．６ Ｕ／ｍＬ，木聚糖酶最適ｐＨ和溫度分別為６．５和４０ ℃。

關鍵詞：中溫木聚糖酶；真菌；篩選菌株；產酶條件

中圖分類號：ＴＱ９２０．１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3475-04

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｅｒａｔｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ β－Ｘｙｌａｎａｓｅ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｕｎｇｉ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

ＨＵＡ Ｃｈｅｎｇ－ｗｅｉａ，ＪＩＡＯ Ｌｉｎｇ－ｘｉａｂ，ＹＵ Ｊｉａｎｇ－ａｏａ

（ａ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｂ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Fｏｏｄ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ β－ｘｙｌａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｉ， Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８， ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｈｕｍｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｘｉｎｘｉａｎｇ ａｔ ３０ ℃ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｘｙｌａｎ ａｓ the ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＦＬＨ２８ ｗａｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｉｎｇ ｗｅｌｌ ａｔ ２０～４０ ℃； ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０ ℃． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎs ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ， ６．０； ｃｏｒｎｃｏｂ ａｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ； ｐｅｐｔｏｎｅ， ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ａｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ； ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ for ４ ｄ ａｔ ３０ ℃． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎs， ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ to ５６２．６ Ｕ／ｍＬ． Ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｘｙｌａｎａｓｅ ｗａｓ ６．５ ａｎｄ ４０ ℃ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｘｙｌａｎａｓｅ； ｆｕｎｇｉ strain（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８）； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

木聚糖是植物細胞主要結構性多糖，主鏈由多個β－Ｄ－吡喃木糖基通過β－１，４－糖苷鍵連接的復雜分子多聚糖，主鏈連有各種取代基，分子中含有許多葡萄糖醛酸、乙酰基、阿拉伯糖、阿魏酸、香豆酸等側鏈基團［１］。木聚糖是自然界含量僅次于纖維素的第二大類多糖，是半纖維素中含量最豐富的一種組分，占地球可再生有機碳的１／３［２］。它的存在使谷物中的營養物質不能被充分暴露于動物消化液的表面，進而影響動物的消化吸收，降低了飼料的營養價值。木聚糖酶（Ｘｙｌａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．８）主要以內切方式作用于木聚糖主鏈上的β－１，４－糖苷鍵，水解生成以木二糖為主的低聚糖［３］，它在生物轉化、食品、飼料、醫藥、能源、造紙、紡織等行業中有著廣泛的應用［４］，具有很大的商業開發價值。迄今為止，關于產無纖維素酶活性木聚糖酶的菌株報道很多，包括細菌、真菌和放線菌，其中曲霉屬和芽孢桿菌屬種類最多［５－８］。

目前，關于耐高溫木聚糖酶菌株的篩選是木聚糖酶研究的一個熱點，耐高溫木聚糖酶對于工業生產木糖高溫快速反應及飼料用酶制粒過程的酶活損失有一定的優點，但在３７ ℃左右普遍存在酶活較低的問題，對于一些瘤胃動物來說，其最適作用ｐＨ往往偏離中性的范圍，不利于在飼料中的應用。因此，篩選中溫、最適ｐＨ中性且在一定范圍內有良好熱穩定性的產木聚糖酶菌株對于木聚糖酶在飼料中的應用具有重要的作用。目前人們研究較多的真菌主要包括木霉、毛霉和曲霉等，關于鐮刀菌屬（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌種產木聚糖酶的研究很少，且產酶水平較低，在３０ Ｕ／ｍＬ以下［９－１２］。試驗篩選得到１株高產木聚糖酶菌株Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８，并對其產酶條件進行了初步研究。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 樣品采集 樣品采集于河南新鄉周邊土壤及太行山南麓叢林土壤及腐殖質中。

１．１．２ 培養基

１）篩選培養基（ｇ／Ｌ）：ＮＨ４Ｃｌ １．０，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１，ＣａＣｌ２ ０．４，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１，玉米芯木聚糖１．０，瓊脂粉１５.0，用ＨＣｌ調ｐＨ 至５．５。

２）分離培養基：ＰＤＡ培養基［１３］。

３）發酵基礎鹽培養基（ｇ／Ｌ）：ＫＨ２ＰＯ４ １．０，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３，ＣａＣｌ２ ０．４，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１。

１．１．３ 試劑 酵母提取物、胰蛋白胨（Ｏｘｏｉｄ）；櫸木木聚糖、地衣多糖、昆布多糖、微晶纖維素（Ａｖｉｃｅｌ）、 ＣＭＣ－Ｎａ、木糖（Ｓｉｇｍａ）；標準低相對分子質量蛋白質（中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所）；玉米芯木聚糖（自制）；其他試劑均為分析純。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 產木聚糖酶菌株分離 分別取土樣及腐殖質１ ｇ左右，加入裝有滅菌的１０ ｍＬ ０．９％的ＮａＣｌ溶液的小三角瓶中，室溫振蕩３０ ｍｉｎ，取０．１ ｍＬ 涂布篩選平板，倒置，于３０ ℃培養３～５ ｄ。用滅菌牙簽挑取單菌落菌絲，轉接于ＰＤＡ分離培養基進行單菌落分離。

１．２．２ 產木聚糖酶菌株復篩 用接種鏟取面積約１ ｃｍ２ 的菌塊，接種于含有蛋白胨１０ ｇ／Ｌ、酵母粉１０ ｇ／Ｌ和大麥粉２０ ｇ／Ｌ的發酵培養基上，１８０ ｒ／ｍｉｎ，３０ ℃培養３～5 ｄ。取發酵液１ ｍＬ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取上清液測定酶活性。

１．２．３ 木聚糖酶活性測定 取１．０ ｍＬ底物溶液與經適當稀釋的酶液０．１ ｍＬ混合，反應１０ ｍｉｎ后，沸水煮５ ｍｉｎ中止反應，以木糖等作標準，酶活性通過ＤＮＳ法測定還原糖含量得出［１４］。酶活性單位的定義為：４０ ℃、ｐＨ ６．５的磷酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）及底物濃度為１0 g/L條件下，每分鐘生成１ μｍｏｌ還原糖所需要的酶量為１個酶活性單位。

１．２．４ 菌種初步鑒定 肉眼觀察菌落形態和顏色等，石炭酸－棉藍染色，顯微鏡觀察菌絲、分生孢子梗及孢子形態。

１．２．５ 木聚糖酶酶譜分析 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳［１５］中加入０．１％木聚糖，電泳完畢，２０％異丙醇復性３次，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ６．５的磷酸緩沖液浸泡３次，每次１０ ｍｉｎ，直到紫外下顯示透明條帶。

１．２．６ 產木聚糖酶條件優化 ３０ ℃生長４ ｄ的菌落制成孢子懸液（１０８個／ｍＬ），接種添加各種氮源和碳源的基礎鹽培養基，５００ ｍＬ三角瓶裝量２５ ｍＬ。考查不同條件對產酶的影響，試驗結果為３次平行試驗的平均值。

１．２．７ 產木聚糖酶最適ｐＨ和最適溫度確定 ４０ ℃下，分別測定重組酶在ｐＨ ２．５～１１．０的４種不同緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，檸檬酸緩沖液ｐＨ ２．５～５．５，ＭＥＳ緩沖液ｐＨ ５．０～７．０，磷酸緩沖液ｐＨ ６．０～８．５，甘氨酸－ＮａＯＨ緩沖液ｐＨ ８．５～１１．０）中的相對酶活性，以最高酶活性為１００％；分別于２０～９０ ℃測定相對酶活性，以最高酶活性為１００％。結果為３次試驗數據的平均值。

２ 結果與分析

２．１ 產木聚糖酶菌株篩選結果

經含單一碳源的木聚糖篩選平板和３０ ℃篩選，共篩選得到產木聚糖酶真菌菌株２４株，經搖瓶發酵和酶活性測定，發現1株真菌產酶活性較高，為４２４．２ Ｕ／ｍＬ。該菌株在２０～４０ ℃范圍內生長良好，最適生長溫度３０ ℃左右。ＰＤＡ培養基３０ ℃培養４ ｄ的單菌落呈突起絮狀，菌絲白色疏松（圖１ａ），背面呈淺褐色（圖１ｂ）。

石炭酸－棉藍染色的菌絲分枝有隔；分生孢子梗單生，散生于氣生菌絲上，產生大型分生孢子，鐮刀形（圖２）。因此，根據菌落外觀形態、顏色，孢子和孢子梗形態［１６］，初步鑒定該菌株為鐮刀菌屬，菌株命名為Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８。

２．２ 木聚糖酶酶譜分析結果

為考查鐮刀菌ＦＬＨ28是否產多個木聚糖酶，取粗酶液進行木聚糖酶的酶譜分析。結果顯示，酶譜只有一條透明帶（圖３），相對分子質量約為２２ ６00，和多數產木聚糖酶真菌１１家族相似。

２．３ 鐮刀菌ＦＬＨ２８產木聚糖酶條件優化結果

２．３．１ 不同碳源對產木聚糖酶的影響 在含有蛋白胨和酵母粉各１０ ｇ／Ｌ的基礎鹽培養基中，分別添加２０ ｇ／Ｌ的經粉碎過６０目篩的玉米芯、玉米稈、大麥麩皮、稻草粉、米糠和甘蔗渣５種碳源進行產酶試驗，１８０ ｒ／ｍｉｎ，３０ ℃培養４ ｄ，結果（圖４）顯示，以玉米芯和玉米稈作碳源時產酶效果較好，其中以玉米芯為碳源時木聚糖酶活性可達４２６．８ Ｕ／ｍＬ。因此選用玉米芯為碳源進行后續產酶試驗。

２．３．２ 碳源添加量對產木聚糖酶的影響 于含有蛋白胨和酵母粉各１０ ｇ／Ｌ的基礎鹽培養基中，分別添加不同量玉米芯進行產木聚糖酶試驗，結果表明，在玉米芯添加量為５０ ｇ／Ｌ時，酶活性最高（圖５）。隨玉米芯含量的增加，酶活性反而有下降的趨勢，可能是含量過高的玉米芯影響培養基的流動性，降低氧傳遞速率所致。

２．３．３ 氮源對產木聚糖酶的影響 通過添加不同種類和數量的氮源進行試驗，３０ ℃培養４ ｄ，測定發酵液酶活性，確定產酶的最佳氮源。結果（表１）表明，以復合氮源豆粕粉＋玉米漿及酵母粉＋蛋白胨＋玉米漿較好，酶活性分別為４７３．６和４８２．５ Ｕ／ｍＬ，即添加玉米漿的復合氮源對木聚糖酶的產生具有較強的促進作用，可能是由于玉米漿中營養成分全面所致，具體原因有待進一步分析。考慮到工業應用成本，后續試驗采用復合氮源豆粕粉＋玉米漿。

２．３．４ 培養基起始ｐＨ對產木聚糖酶的影響 以ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４緩沖體系配制濃度為１００ ｍｍｏｌ／Ｌ、不同ｐＨ（４．０～８．０）的培養基，接種等量的孢子懸浮液，３０ ℃培養４ ｄ，測定酶活性。結果（圖６）顯示，培養基起始ｐＨ對菌株產酶有明顯的影響，最適產酶培養基起始ｐＨ ６．０左右，在ｐＨ低于５．０及ｐＨ高于７．０時，酶活性顯著下降。

２．３．５ 培養溫度對產木聚糖酶的影響 接種后的培養液分別于２０～４５°Ｃ培養４ ｄ后，取發酵液測定酶活性，結果見圖7。由圖7可見，培養溫度對產酶有顯著影響，產酶最適培養溫度為３０ ℃左右，當培養溫度高于４０ ℃，菌體生物量顯著下降，同時，酶活性也顯著降低。

２．３．６ 培養時間對產木聚糖酶的影響 在上述優化條件下，分別培養不同時間，從２４ ｈ開始，每隔１２ ｈ取樣分析酶活性。結果（圖8）表明，在培養１２０ ｈ時，酶活性最高，達５６２．６ Ｕ／ｍＬ，隨后酶活性出現緩慢下降，在１５６ ｈ發現菌絲有自溶現象，但沒有出現酶活性快速下降趨勢，可能與木聚糖酶對蛋白酶的敏感性低有關。

２．４ FLH28所產木聚糖酶最適ｐＨ和最適溫度

鐮刀菌ＦＬＨ２８所產木聚糖酶最適ｐＨ約６．５（圖9ａ），在ｐＨ ５．０～８．０時相對酶活性可達８０％以上。最適作用溫度約４０ ℃（圖9ｂ），高于７０ ℃，相對酶活性顯著降低，在３０～５０ ℃時相對酶活性可達８５％以上，表明該木聚糖酶有較寬的ｐＨ和溫度作用范圍。

３ 結論

從新鄉周邊土樣及腐殖質中篩選得到１株高產木聚糖酶真菌菌株，經對菌落形態特征及分生孢子梗和分生孢子形態的顯微觀察，初步鑒定為鐮刀菌屬菌株命名為Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８，其最適生長溫度３０ ℃，在２０～４０ ℃時，生長良好。在培養溫度為３０ ℃，培養基初始ｐＨ ６．０，以玉米芯為碳源，以豆粕粉+玉米漿為氮源，發酵５ ｄ，木聚糖酶活性達５６２．６ Ｕ／ｍＬ。

真菌來源木聚糖酶大都熱穩定性差，酶作用的最適溫度為４０～４５ ℃，５５ ℃以上快速失活。木聚糖酶要廣泛經濟高效應用于飼料工業應具備一定條件，要求飼用木聚糖酶有較好的熱穩定性且在ｐＨ較寬的范圍內能保持較高的活性。而現在顆粒料制粒過程中有一個短暫的高溫過程，溫度為７５～９３ ℃，多數木聚糖酶在此高溫下會大幅度地喪失活性；同時，飼料中的木聚糖酶最終的作用場所是動物正常體溫３７ ℃左右的胃腸中，因此能耐制粒高溫，且在動物正常體溫下具有較高活性成為木聚糖酶在生產中應用的關鍵。菌株Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８所產木聚糖酶在ｐＨ ４．５～８．５時相對酶活性可達６０％以上，在溫度６０ ℃時相對酶活性可達７３％以上，表明該木聚糖酶可很好地應用于食品及飼料工業中。

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