8種柑橘類植物對柑橘碎葉病毒分子組成的影響

摘 要: 探究不同柑橘類型對柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus， CTLV）變異的影響，為研究寄主-CTLV的互作關系提供基礎。將CTLV分離株HH和XLB分別嫁接接種于8種柑橘類植物，對CTLV分離株和獲得的亞分離株樣品進行CP基因的限制性長度多態性（RFLP）和單鏈構象多態性（SSCP）分析，以及序列比較。結果表明HH和XLB與其各自在不同柑橘植株上的亞分離株的CP/Hinf I RFLP酶切圖譜無明顯差異；混合侵染的CTLV分離株HH和其亞分離株之間的SSCP譜型存在差異，株系構成單一的CTLV分離株XLB與其亞分離株間的SSCP譜型差異不明顯。通過序列分析進一步證實CTLV在不同寄主上其CP基因有幾個核苷酸位點發生了變異。CTLV可能受寄主植物的影響發生了變異。

關鍵詞: 柑橘； 柑橘碎葉病毒； CP基因

中圖分類號：Ｓ６６6 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0090－０4

Influence of eight citrus cultivars on the composition of Citrus tatter leaf virus

LIU Ke-hong， SONG Zhen， ZHOU Yan， LI Zhong-an， ZHOU Chang-yong*

（Citrus Research Institute， Southwest University， Beibei，Chongqing 400712 China）

Abstract: Citrus tatter leaf disease caused by Citrus tatter leaf virus （CTLV） is an economically important systemic disease of citrus in the world． It is known that CTLV is widespread in China， and it has caused tremendous economic loss in Zhejiang， Hunan， Fujian and Guangxi provinces． So it is important to understand the influence of citrus cultivars on the composition of CTLV． 48 sub-isolates of CTLV isolates HH and XLB were obtained by inoculating HH and XLB to Jincheng， Lemon， Ponkan， Tangerine， Daidai， None， Fragrant orange and Rusk citrange． Then restriction fragment length polymorphism （RFLP）， single-strand conformation polymorphism （SSCP） and sequence analysis were applied to analyze the variation of HH， XLB and their sub-isolates． The results showed that the RFLP patterns of coat protein gene （CP） digested by restriction enzyme Hinf I of CTLV isolate HH， XLB and their sub-isolates were similar． Based on SSCP analysis， HH mixed with several strains changed its polymorphism in some hosts． However， XLB with single strain did not change its polymorphism in different citrus hosts． In sequence analysis， it was found that the nucleotide identity in the CP gene of isolate HH and its sub-isolates was 99．3% to 100%， and that of isolate XLB and its sub-isolates was 96．5% to 99．8%． The results indicated that the composition of CTLV isolates might be changed in different citrus hosts．

Key words: Citrus cultivars； Citrus tatter leaf virus （CTLV）； Coat protein gene

柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus， CTLV）引起的柑橘碎葉病是一種重要的柑橘病害，主要危害枳及其雜種作砧木的柑橘樹，引起植株黃化、衰弱，甚至整株枯死，以枳作砧木的寬皮柑橘感染CTLV后減產約25%。CTLV主要分布于美國、日本、南非和澳大利亞等國，目前CTLV在我國浙江、湖南、福建和廣西等地的部分柑橘產區也造成了較為嚴重的危害[1-2]。

CTLV屬發形病毒屬（Capillovirus）。基因組為正義單鏈RNA分子，全長6496 nt，5′端具帽子結構，3′端具（PolycA）尾巴，包含2個重疊的開放閱讀框: ORF1 （6．3 kb） 和ORF2 （1．0 kb），其中ORF1編碼一個分子質量為241 kDa的多聚蛋白，外殼蛋白（Coat protein， CP） 基因位于其C端，大小為27 kDa，多聚蛋白N端具甲基轉移酶、解旋酶、類木瓜蛋白酶和聚合酶功能。ORF2位于ORF1之內，靠近基因組RNA的3′端，編碼36 kDa的運動蛋白[3-4]。通過形態學、血清學和分子生物學方面的研究，CTLV被認為是蘋果莖溝病毒（Apple stem groove virus， ASGV）的分離物[5]。

以往的研究表明，當煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virua， CTV）、玉米線條病毒（Maize streak virus， MSV）接種到不同的寄主上時，其CP基因序列以及病毒的種群遺傳結構都會發生變化[6-8]。目前還缺乏不同寄主對CTLV變異影響的相關研究，因此我們運用限制性片段長度多態性（RFLP）、單鏈構象多態性（SSCP）和序列分析的方法對接種于8種不同類型柑橘植株上的CTLV分離株進行分析，以期為研究寄主-CTLV的互作關系提供基礎。

1 材料和方法

1．1 供試材料

CTLV強毒株HH和弱毒株XLB分別嫁接接種于一年生錦橙（Citrus sinesis L． Osbeck）、檸檬（C． limon L． Burm）、椪柑（C． reticulate Blanco．）、紅橘（C．aurantium L．）、代代酸橙（C． aurantium L． var． daidai）、山小桔）Glycosmis pentaphyll）、香橙（C． junos Sieb． ex Tan．）實生苗和卡里佐枳橙[Poncitrus trifoliate （L．） Raf． × C． sinensis （L．） Osbeck]砧臘斯克枳橙[C． sinensis （L．） Osbeck × Poncirus trifoliata Raff]嫁接苗。每株植株嫁接毒源植株的1個芽和2塊皮，每種柑橘類型3個重復。嫁接成活后保存在24 ℃溫室中。所有試材均由中國農業科學院柑桔研究所脫毒中心提供。

1．2 CP基因的合成和擴增

參照周常勇等[9]微量抽提法提取樣品總核酸，并合成CP基因的特異性引物ASCT-3’（5'-AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3'）；CTL5607（5'-CCCTCTC AGCTAGAATTG AA-3'）[5，10]，引物由上海博尚生物技術有限公司合成。cDNA的合成，取2 μL總核酸，加入3 μL超純水，95 ℃解鏈3 min，然后逆轉錄。20 μL逆轉錄體系為: 解鏈模板5 μL，10 μmoL下游引物0．5 μL，5×PCR buffer 4 μL，10 mmoL dNTPs 1 μL （TaKaRa)， RNAsin 0．5 μL，RTase （Toyobo) 0．5 μL，超純水8．5 μL。逆轉錄條件為: 42 ℃ 30 min。逆轉錄完成后將cDNA放于-20 ℃備用。25 μL PCR反應體系為: cDNA模板1 μL，10 μmoL上、下游引物各0．6 μL，10 × PCR buffer 2．5 μL，10 mmoL dNTPs 0．5 μL（TaKaRa），25 mmoL MgCl2 1．5 μL，5 U Taq酶（TaKaRa）0．3 μL，超純水18 μL。反應條件為: 94 ℃ 2 min；40個循環（94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s）；72 ℃ 10 min。RT-PCR產物經1．2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，用凝膠成像系統（Bio-Rad）觀察結果。

1．3 RFLP分析

取20 μL擴增產物與限制性內切酶Hinf I（Toyobo）在37 ℃下水浴酶切1 h后，進行3%超純瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在凝膠成像系統中觀測結果。

1．4 SSCP分析

參照Rubio等[11]的方法，取1 μL PCR產物與9 μL甲酰胺和2 μL染料混勻，99 ℃下變性15 min后立即放入冰水中保存，隨后進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢后，銀染，觀察結果。

1．5 CP基因序列分析

使用膠回收試劑盒（Omega）對RT-PCR產物進行回收、純化。將1 μL純化產物連接到pMD18-T載體（Takara）上后，導入感受態細胞DH5а（Takara）中。涂板后在每個培養皿中選擇3~5個單斑進行培養。獲得的菌液送往上海博尚生物技術有限公司測序。測序結果經拼接后，用BioEdit7．0軟件進行分析。

2 結果與分析

2．1 RT-PCR擴增

將毒源HH和XLB分別嫁接接種在錦橙、檸檬、椪柑、紅橘、代代酸橙、山小橘、香橙和臘斯克枳橙。嫁接接種75 d后，對樣品提取出的總核酸進行RT-PCR擴增，都產生一條與預期相符，大小為889 bp的片段（圖1），共獲得48個亞分離株。

2．2 CP/Hinf I RFLP分析

毒源HH和XLB及其亞分離株的PCR擴增產物應用限制性內切酶HinfⅠ進行酶切，RFLP圖譜顯示，毒源HH和XLB與其嫁接接種后所獲得的各亞分離株RFLP圖譜沒有發生明顯的變化（圖2、3）。在8種柑橘類型上設立的3個重復的譜型完全一致。

2．3 CP/SSCP分析

毒源HH和XLB及其亞分離株進行CP/SSCP分析，結果顯示接種于代代、紅橘和錦橙獲得的亞分離株CP/SSCP特征性譜帶為3條，與毒源HH相比沒有發生變化；而接種于檸檬和臘斯克枳橙獲得的亞分離株CP/SSCP征性譜帶為2條，與毒源HH相比減少了1條；接種于椪柑、山小橘和香橙獲得的亞分離株CP/SSCP特征性譜帶為4條，與毒源HH相比增加了1條。毒源XLB和其8個亞分離株的CP/SSCP特征性譜帶均為2條（圖4、5）。2個毒源在8種柑橘類型上設立的3個重復其譜型完全一致。

2．4 序列分析

毒源HH與接種后獲得的亞分離株其CP基因的核苷酸序列同源性為 99．3%～100%，由核苷酸序列推導出的氨基酸序列其最大相似性為98．5%～100.0%。毒源XLB與接種后所得的亞分離株其CP基因的核苷酸序列同源性為96．5%～99．8%，由核苷酸序列推導出的氨基酸序列其最大相似性為93．2%～99．6%。經核苷酸序列的比較發現，在8種柑橘類型上設立的3個重復幾乎是完全相同的亞分離株。

3 討 論

植物病毒與寄主間存在協同進化關系，病毒種群遺傳結構在同一個寄主內長時間保持穩定，轉移到不同寄主植物后，病毒為適應新的環境其種群遺傳結構可能發生改變，這種改變是病毒和寄主相互作用的結果。由于CP基因具有較高的保守性，因此本研究以CP基因為靶標，對柑橘類寄主對CTLV變異的影響進行了研究，結果表明寄主類型對構成單一的CTLV分離株，其種群遺傳結構無明顯影響；而多株系混合侵染的CTLV毒源在不同寄主中其種群遺傳結構發生了變化。在對CTV的研究中也發現了類似的現象[12]，并認為這種現象可能是因為病毒株系在不同類型柑橘上的適應性存在差異，當進入新的寄主時病毒各株系間原有的平衡被打破，株系間的互作使某些株系出現被抑制的現象，或者是由于不同類型的柑橘在各自與病毒的共同演化過程中產生了不同的防御機制，從而能夠特異性地抑制某些病毒株系。

本研究中供試毒源的CP/ Hinf I酶切圖譜均無明顯變化，這一現象可能是因為RFLP的靈敏度較低，只能檢測出CTLV中含量較高的主要株系，其他含量低的次要株系沒有檢測到。在酶切圖譜中２個CTLV分離株及各亞分離株都有個21 bp的小片段未顯示，ＨＨ及其亞分離株酶切產生的120、124 bp的片段和XLB及其亞分離株酶切產生的96、120 bp的片段大小接近凝膠無法分離。而SSCP具有較高的靈敏性，可以檢測出CTLV亞分離株間出現的微小變異。測序結果表明接種到不同的寄主上后CTLV的CP基因有幾個核苷酸位點發生了變異，但沒有發現固定的變異位點。在此實驗中序列測定時挑取克隆單斑的數量有限，測定的序列有限，測定的僅是HH及各亞分離株主要株系的序列，而通過RFLP和SSCP圖譜可觀察到，其主要株系沒有明顯變化，這與SSCP的結果相對應。CTLV分離株在不同柑橘類寄主中存在變異，這與寄主－CTLV的互作有關。但寄主－CTLV互作的機制以及在不同寄主中其致病力的變化，有待于更進一步的研究。

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